Marquage immunoplasmonique multiplexé sur échantillons histologiques pour le diagnostic du cancer

Le cancer est un fléau grave et d'actualité, il suffit de consulter les statistiques pour le constater. Il s'agit maintenant de la principale cause de décès chez les canadiens et les canadiennes, devant les maladies cardiovasculaires. Le diagnostic précoce et précis du cancer permet d'améliorer le pronostic des patients. Bien que les méthodes diagnostiques actuelles aient permis d'améliorer la qualité des diagnostics de cancer, elles ne sont toujours pas optimales. En général, un échantillon de biopsie est prélevé afin d'être analysé microscopiquement par un pathologiste dans le but d'établir un diagnostic. La méthode la plus fréquemment utilisée est la combinaison de deux techniques, la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) et l'immunohistochimie (IHC). Cependant, cette procédure est subjective, semi-quantitative et permet peu de marquage multiplexé. C'est pourquoi l'immunoplasmonique (IP) offre une alternative intéressante. Il s'agit d'une technique basée sur l'observation au microscope d'échantillons biologiques contenant des nanoparticules plasmoniques (NPs) ayant des propriétés optiques uniques. Les NPs se démarquent puisqu'elles sont des biomarqueurs quantitatifs, multicolores pouvant être fonctionnalisées. Les études précédentes sur le marquage IP n'ont pas abordé l'impact de la coloration H&E des échantillons sur l'observation des NPs dans l'environnement cellulaire. Il est primordial pour les pathologistes de pouvoir observer les résultats du marquage IP dans son contexte cellulaire puisque la présence d'une protéine peut avoir des significations différentes selon les cellules dans lesquelles elle est exprimée. Au total, 120 conditions ont été analysées au microscope en champ clair, puis en champ sombre à l'aide d'un dispositif d'illumination latérale (Side-Illumination ou SI) pour l'observation des NPs. Quatre couleurs de NPs (rouge, vert, bleu et jaune) ont été choisies afin de montrer les capacités de multiplexage de l'IP. Il sera démontré dans ce mémoire que la combinaison de coloration H&E optimale, suggérée pour l'implantation future de l'IP dans les laboratoires de pathologie, est l'utilisation de l'hématoxyline de Gill (ou Harris) avec l'éosine B. Cette coloration ne nuit pas à l'observation du marquage IP dans trois types d'échantillons: les cellules entières adhérées à la lame de microscope et les tranches de cellules ou de tissus fixés dans la formaline et enrobés de paraffine (cellules FFPE ou tissu FFPE). Enfin, l'utilisation de lames de microscope chargées positivement a mis en évidence la problématique de l'attraction électrostatique non-spécifique entre les NPs et la lame. Il a été déterminé que la fonctionnalisation des NPs (anticorps anti-HER2) permet de neutraliser, en grande partie, la charge de surface des NPs et donc de réduire significativement (p<0,01) l'adhésion non-spécifique des NPs au substrat.

Abstract

Cancer is a serious and recurring disease, you just need to look at the statistics to be convinced. In fact, it is now the leading cause of death among Canadians, in front of cardiovascular disease. It has been shown that early and accurate diagnosis of cancer improves patient prognosis. However, although current diagnostic methods have improved the quality of cancer diagnoses, they still are not optimal. Usually, a biopsy sample is used for microscopic analysis by a pathologist to establish a diagnosis. The most frequently used method is the combination of two techniques: hematoxylin and eosin staining (H&E) and immunohistochemistry (IHC). However, this procedure is subjective, semi-quantitative and does not allow multiplexed labeling. That is why, immunoplasmonics (IP) offers an interesting alternative. It is a technique based on the microscopic observation of a biological sample that contains plasmonic nanoparticles (NPs) which have unique optical properties. NPs stand out because are quantitative and multicolored biomarkers that can be functionalized. Previous studies on IP have not addressed the effect of H&E counterstaining on the observation of NPs in the cellular environment. However, counterstaining is central to the correct interpretation of immunolabeling, as different cells can express similar antigens with different significations. A total of 120 conditions were first analyzed under a bright field microscope, then in dark field using a Side-Illumination (SI) device for the observation of NPs. Four colors of NPs (red, green, blue and yellow) have been chosen to show the multiplexing capabilities of the IP. It will be demonstrated in this master's thesis that the optimal H&E staining combination suggested for future implantation of IP in pathology laboratories is the use of Gill (or Harris) hematoxylin with eosin B. This staining did not interfere with the observation of IP labeling in three types of samples: whole cells adhered to the microscope slide, slices of paraffin-embedded cells (FFPE cells) and slices of paraffin-embedded tissue (FFPE tissue). Finally, the use of positively charged microscope slides has emphasized the problematic of non-specific electrostatic attraction between the NPs and the slide. It was determined that the functionalization of the NPs (anti-HER2 antibodies) largely neutralizes the surface charge of the NPs and therefore significantly (p <0.01) reduce the non-specific adhesion of the NPs to the substrate.