Lyophilisation et concentration de complexes chitosane/ADN et chitosane/ARNic pour la thérapie génique

Beaucoup de ressources ont été investies au cours des dernières décennies pour développer des vecteurs de livraison de gènes polymériques sécuritaires et efficaces pour des applications cliniques. Le chitosane (CS), un polysaccharide cationique naturel, permet de condenser l'ADN ou l'ARN interférent court (ARNic) pour former des polyplexes dont l'efficacité de transfection élevée a été démontrée in vitro et in vivo. Afin d'être utilisée en clinique, ces formulations doivent toutefois atteindre des doses thérapeutiques; elles doivent être adaptées pour un usage intraveineux; et elles doivent être stabilisées pour le transport et l'entreposage. Les objectifs de la thèse étaient: d'identifier des formulations biocompatibles de complexes CS/ADN et CS/ARNic pouvant être lyophilisées et concentrées, tout en préservant leurs propriétés et en demeurant isotoniques; de développer des compositions lyophilisées de polyplexes hémocompatibles ayant un pH neutre; et d'optimiser les cycles de lyophilisation des formulations. Une première étude, menée sur des polyplexes CS/ADN préparés à un ratio amine/phosphate (N/P) de 5, a permis de déterminer que l'ajout de 0.5% m/V de sucrose, dextran 5 kDa ou tréhalose, combiné à 3.5 mM histidine (pH 6.5), était nécessaire pour préserver le pH des formulations et éviter l'agrégation des complexes pendant la lyophilisation. Ces compositions pouvaient ensuite être réhydratées à une concentration 20 fois plus élevée (~1 mg d'ADN/mL), tout en ayant un pH et une tonicité quasi physiologiques. Les formulations concentrées ont généré des polyplexes ayant des diamètres inférieurs à 200 nm, des indices de polydispersité (PDI) inférieurs à 0.32, et des potentiels zêta supérieurs à 19 mV. Leurs taux de transfection et d'expression de la luciférase étaient supérieurs ou égaux à 65% et 75% des polyplexes fraîchement préparés sans excipients respectivement. Finalement, les compositions n'étaient pas cytotoxiques pour la lignée cellulaire rénale HEK293 aux concentrations évaluées. Ces connaissances ont ensuite été adaptées pour la formulation des polyplexes CS/ARNic. L'analyse de l'influence des tampons sur les compositions a démontré que les propriétés physicochimiques des polyplexes varient selon la valence de leurs contre-ions dans le tampon, selon la force ionique, et selon le pH des formulations. Les polyplexes préparés à N/P = 2 en présence d'acide maléique ou de phosphate de sodium agrégeaient lorsque le pH et/ou la force ionique augmentaient; les résultats optimaux ont été obtenus avec histidine, soit en absence de contre-ions anioniques divalents. La concentration des tampons compatibles a été optimisée pour