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Lyophilisation et concentration de complexes chitosane/ADN et chitosane/ARNic pour la thérapie génique

Daniel Veilleux

Thèse de doctorat (2016)

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Citer ce document: Veilleux, D. (2016). Lyophilisation et concentration de complexes chitosane/ADN et chitosane/ARNic pour la thérapie génique (Thèse de doctorat, École Polytechnique de Montréal). Tiré de https://publications.polymtl.ca/2263/
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Résumé

RÉSUMÉ Beaucoup de ressources ont été investies au cours des dernières décennies pour développer des vecteurs de livraison de gènes polymériques sécuritaires et efficaces pour des applications cliniques. Le chitosane (CS), un polysaccharide cationique naturel, permet de condenser l’ADN ou l’ARN interférent court (ARNic) pour former des polyplexes dont l’efficacité de transfection élevée a été démontrée in vitro et in vivo. Afin d’être utilisée en clinique, ces formulations doivent toutefois atteindre des doses thérapeutiques; elles doivent être adaptées pour un usage intraveineux; et elles doivent être stabilisées pour le transport et l’entreposage. Les objectifs de la thèse étaient: d’identifier des formulations biocompatibles de complexes CS/ADN et CS/ARNic pouvant être lyophilisées et concentrées, tout en préservant leurs propriétés et en demeurant isotoniques; de développer des compositions lyophilisées de polyplexes hémocompatibles ayant un pH neutre; et d’optimiser les cycles de lyophilisation des formulations. Une première étude, menée sur des polyplexes CS/ADN préparés à un ratio amine/phosphate (N/P) de 5, a permis de déterminer que l’ajout de 0.5% m/V de sucrose, dextran 5 kDa ou tréhalose, combiné à 3.5 mM histidine (pH 6.5), était nécessaire pour préserver le pH des formulations et éviter l’agrégation des complexes pendant la lyophilisation. Ces compositions pouvaient ensuite être réhydratées à une concentration 20 fois plus élevée (~1 mg d’ADN/mL), tout en ayant un pH et une tonicité quasi physiologiques. Les formulations concentrées ont généré des polyplexes ayant des diamètres inférieurs à 200 nm, des indices de polydispersité (PDI) inférieurs à 0.32, et des potentiels zêta supérieurs à 19 mV. Leurs taux de transfection et d’expression de la luciférase étaient supérieurs ou égaux à 65% et 75% des polyplexes fraîchement préparés sans excipients respectivement. Finalement, les compositions n’étaient pas cytotoxiques pour la lignée cellulaire rénale HEK293 aux concentrations évaluées. Ces connaissances ont ensuite été adaptées pour la formulation des polyplexes CS/ARNic. L’analyse de l’influence des tampons sur les compositions a démontré que les propriétés physicochimiques des polyplexes varient selon la valence de leurs contre-ions dans le tampon, selon la force ionique, et selon le pH des formulations. Les polyplexes préparés à N/P = 2 en présence d’acide maléique ou de phosphate de sodium agrégeaient lorsque le pH et/ou la force ionique augmentaient; les résultats optimaux ont été obtenus avec histidine, soit en absence de contre-ions anioniques divalents. La concentration des tampons compatibles a été optimisée pour----------ABSTRACT Research to develop safe and efficient non-viral gene delivery vectors for clinical applications has gained momentum in recent years. Chitosan (CS) is a natural cationic polysaccharide which has been successfully tailored to self-assemble with DNA or small interfering RNA (siRNA) to form polyelectrolyte complexes with high in vitro and in vivo transfection efficiencies. Despite their great therapeutic potential, CS/DNA and CS/siRNA polyplex formulations require further improvement for successful clinical applications: their concentration should be increased to reach therapeutic dosages, they should be optimized for intravenous administration, and they should be stabilized for shipping and long term storage. The goals of the thesis were: to identify biocompatible CS/DNA and CS/siRNA formulations that can be lyophilized and rehydrated to higher concentrations while preserving their properties and being isotonic; to develop hemocompatible, neutral pH, lyophilized polyplex compositions; and to optimize freeze-drying cycles for these compositions. An initial study done with CS/DNA polyplexes, prepared at amine to phosphate (N/P) ratio of 5, showed that 3.5 mM histidine buffer (pH 6.5), combined with one of 0.5 % wt/vol sucrose, 5kDa dextran, or trehalose, was required in the formulations to prevent complex aggregation during freeze-drying. These compositions could then be rehydrated to final concentrations up to 20-fold higher (~ 1 mg of DNA/mL), while maintaining near physiological pH and tonicity. The resulting polyplexes were predominantly spherical, with diameters below 200 nm, polydispersity indexes (PDI) below 0.32, and zeta potentials above +19 mV. Rehydrated formulations had transfection efficiencies and luciferase expression levels no less than 65% and 75% of fresh polyplexes without excipients respectively. They did not affect the viability of the HEK 293 kidney cell line. This knowledge was then adapted to CS/siRNA systems. Analysis of the influence of buffers on polyplexes showed three buffer parameters affect their physicochemical properties, namely the valency of their counterions, their ionic strength, and the formulation pH. Polyplexes prepared at N/P = 2 in maleic acid or sodium phosphate aggregated when pH and/or ionic strength increased, whereas optimal results were obtained with histidine, in absence of divalent anionic counterions. Compatible buffers were then optimized for freeze-drying of uncoated and hyaluronic acid (HA)-coated polyplexes in 0.5% wt/vol trehalose. Compositions prepared at pH 6.5 could be lyophilised with 1 mM histidine, whereas HA-coated polyplexes prepared at pH 7 had to be

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Département: Institut de génie biomédical
Directeur de mémoire/thèse: Michael Buschmann et Marc Lavertu
Date du dépôt: 21 mars 2017 11:23
Dernière modification: 01 sept. 2017 17:32
Adresse URL de PolyPublie: https://publications.polymtl.ca/2263/

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