Segmentation automatique des images de fibres d'ADN pour la quantification du stress réplicatif

La réplication de l'ADN est un processus complexe géré par une multitude d'interactions moléculaires permettant une transmission précise de l'information génétique de la cellule mère vers les cellules filles. Parmi les facteurs pouvant porter atteinte à la fidélité de ce processus, on trouve le Stress Réplicatif. Il s'agit de l'ensemble des phénomènes entraînant le ralentissement voire l'arrêt anormal des fourches de réplication. S'il n'est pas maîtrisé, le stress réplicatif peut causer des ruptures du double brin d'ADN ce qui peut avoir des conséquences graves sur la stabilité du génome, la survie de la cellule et conduire au développement de cancers, de maladies neurodégénératives ou d'autres troubles du développement. Il existe plusieurs techniques d'imagerie de l'ADN par fluorescence permettant l'évaluation de la progression des fourches de réplication au niveau moléculaire. Ces techniques reposent sur l'incorporation d'analogues de nucléotides tels que chloro- (CldU), iodo- (IdU), ou bromo-deoxyuridine (BrdU) dans le double brin en cours de réplication. L'expérience la plus classique repose sur l'incorporation successive de deux types d'analogues de nucléotides (IdU et CldU) dans le milieu cellulaire. Une fois ces nucléotides exogènes intégrés dans le double brin de l'ADN répliqué, on lyse les cellules et on répartit l'ADN sur une lame de microscope. Les brins contenant les nucléotides exogènes peuvent être imagés par immunofluorescence. L'image obtenue est constituée de deux couleurs correspondant à chacun des deux types d'analogues de nucléotides. La mesure des longueurs de chaque section fluorescente permet la quantification de la vitesse de progression des fourches de réplication et donc l'évaluation des effets du stress réplicatif. La mesure de la longueur des fibres fluorescentes d'ADN est généralement réalisée manuellement. Cette opération, en plus d'être longue et fastidieuse, peut être sujette à des variations inter- et intra- opérateurs provenant principalement de déférences dans le choix des fibres. La détection des fibres d'ADN est difficile car ces dernières sont souvent fragmentées en plusieurs morceaux espacés et peuvent s'enchevêtrer en agrégats. De plus, les fibres sont parfois difficile à distinguer du bruit en arrière-plan causé par les liaisons non-spécifiques des anticorps fluorescents. Malgré la profusion des algorithmes de segmentation de structures curvilignes (vaisseaux sanguins, réseaux neuronaux, routes, fissures sur béton...), très peu de travaux sont dédiés au traitement des images de fibres d'ADN. Nous avons mis au point un algorithme intitulé ADFA (Automated DNA Fiber Analysis) permettant la segmentation automatique des fibres d'ADN ainsi que la mesure de leur longueur respective. Cet algorithme se divise en trois parties : (i) Une extraction des objets de l'image par analyse des contours. Notre méthode de segmentation des contours se basera sur des techniques classiques d'analyse du gradient de l'image (Marr-Hildreth et de Canny). (ii) Un prolongement des objets adjacents afin de fusionner les fibres fragmentées. Nous avons développé une méthode de suivi (tracking) basée sur l'orientation et la continuité des objets adjacents. (iii) Une détermination du type d'analogue de nucléotide par comparaison des couleurs. Pour ce faire, nous analyserons les deux canaux (vert et rouge) de l'image le long de chaque fibre. Notre algorithme a été testé sur un grand nombre d'images de qualité variable et acquises à partir de différents contextes de stress réplicatif. La comparaison entre ADFA et plusieurs opérateurs humains montre une forte adéquation entre les deux approches à la fois à l'échelle de chaque fibre et à l'échelle plus globale de l'image. La comparaison d'échantillons soumis ou non soumis à un stress réplicatif a aussi permis de valider les performances de notre algorithme. Enfin, nous avons étudié l'impact du temps d'incubation du second analogue de nucléotide sur les résultats de l'algorithme. Notre algorithme est particulièrement efficace sur des images contenant des fibres d'ADN relativement courtes et peu fractionnées. En revanche, notre méthode de suivi montre des limites lorsqu'il s'agit de fusionner correctement de longues fibres fortement fragmentées et superposées à d'autres brins. Afin d'optimiser les performances d'ADFA, nous recommandons des temps d'incubation courts (20 à 30 minutes) pour chaque analogue de nucléotide dans le but d'obtenir des fibres courtes. Nous recommandons aussi de favoriser la dilution des brins sur la lame de microscope afin d'éviter la formation d'agrégats de fibres difficiles à distinguer. ADFA est disponible en libre accès et a pour vocation de servir de référence pour la mesure des brins d'ADN afin de pallier les problèmes de variabilités inter-opérateurs.