Amélioration de la production et de la qualité des protéines thérapeutiques recombinantes produites en culture en mode cuvée-alimentée de cellules de mammifère

La production de protéines thérapeutiques recombinantes en cellule de mammifère représente aujourd'hui une part importante des revenus des industries biopharmaceutiques. Des avancées considérables ont été réalisées ces 30 dernières années dans l'amélioration des rendements des cultures, notamment grâce au développement des procédés en mode cuvée-alimentée (fed-batch). Cependant, malgré des rendements de plus en plus élevés, la qualité des protéines produites est souvent faible, inconsistante et sujette à une grande variabilité d'une production à l'autre. La glycosylation est l'attribut de qualité des glycoprotéines considérée comme la plus critique car celle-ci influence de manière significative l'efficacité et l'immunogénicité du biothérapeutique. Plus particulièrement, la sialylation a un impact majeur sur le temps de demi-vie du biothérapeutique dans le sérum sanguin. Pour ces raisons, les agences de régulation tels que la Food and Drug Administration (FDA) et l'agence européenne des médicaments (EMA) imposent une caractérisation rigoureuse de la qualité des glycoprotéines, rendant ainsi le contrôle et l'optimisation de la glycosylation un enjeu primordial pour les industries pharmaceutiques. Cela représente un challenge de taille car la glycosylation est influencée par une multitude de facteurs allant du choix de la plateforme cellulaire de production, au type de protéines recombinantes produites ainsi qu'aux conditions de culture. Parmi les facteurs affectant la production et la qualité des protéines recombinantes se trouve l'accumulation des déchets métaboliques parmi lesquels le lactate et l'ammonium sont considérés les plus nocifs. Notamment, l'accumulation de l'ammonium contribue à la dégradation de la glycosylation des protéines recombinantes. Dans cette étude, nous avons visé la réduction de l'accumulation de ces métabolites toxiques dans le but d'améliorer la production et la qualité d'une glycoprotéine thérapeutique modèle, l'interféron α2b (IFNα2b), qui est utilisée dans le traitement contre les maladies virales et les cancers. Dans un premier temps, nous avons démontré l'effet sur la qualité de l'IFNα2b d'une stratégie de génie génétique améliorant le métabolisme central du carbone et réduisant l'accumulation de lactate. En combinant plusieurs techniques complémentaires d'analyse de la glycosylation, nous avons montré que la surexpression du gène de la pyruvate carboxylase cytosolique de levure (PYC2) dans la lignée de cellulaire humaine HEK293 a un effet bénéfique sur la viabilité cellulaire, menant ainsi à un prolongement des conditions favorables pour la glycosylation et l'intégrité de l'IFNα2b. Dans un second temps, nous avons combiné la modification PYC2 à des stratégies de substitution de la glutamine dans le but de réduire l'accumulation d'ammonium. Ces expériences nous ont permis de constater l'effet bénéfique du remplacement de la glutamine par le pyruvate sur la croissance et la viabilité cellulaire ainsi que sur la production protéique. L'alimentation des cellules PYC2 en glucose et en pyruvate, combinée à l'utilisation de précurseurs de la glycosylation a permis de maximiser la production et la qualité de l'IFNα2b. En outre, les cellules surexprimant la PYC2 ont démontré une croissance soutenue, une diminution significative de la production d'ammonium ainsi qu'une meilleure production d'IFNα2b en condition sans glutamine. Cette dernière observation a été exploitée pour développer une stratégie de culture en mode fed-batch) à l'aide d'une solution nutritive concentrée ne contenant pas de glutamine. Cela a permis une réduction drastique de l'accumulation de lactate et d'ammonium, ce qui a eu pour conséquence de doubler la production en interféron α2b en culture en flacons. Des performances améliorées ont également été obtenue lors des cultures en bioréacteur conduisant ainsi, malgré l'absence de glutamine, à la production d'IFNα2b hautement glycosylé. Enfin, nous avons investigué sur le développement d'une méthode permettant de suivre la glycosylation en cours de culture. La technique de résonance plasmonique de surface associée aux lectines a été utilisée pour capturer l'IFNα2b à partir du surnageant de culture afin d'analyser sa qualité. Ces travaux ont permis de mettre en évidence les défis liés à cette approche et des pistes d'amélioration ont été proposées. Ce travail apporte une contribution notable dans l'amélioration des procédés de production de protéines thérapeutiques recombinantes. En plus de représenter une première étude sur l'influence de l'altération du métabolisme central du carbone sur la qualité des glycoprotéines recombinantes, cette étude propose des stratégies efficaces et originales pour réduire simultanément le lactate et l'ammonium, les principaux inhibiteurs des procédés de culture de cellules de mammifère. En effet, grâce à leur phénotype avantageux, l'exploitation des cellules PYC2 a permis de concilier une haute production en glycoprotéines avec une haute qualité, offrant ainsi un outil intéressant pour la production de produits médicamenteux plus efficaces et plus sûrs pour le patient.