Élaboration de nouveaux biomatériaux antibactériens à base de chitosane par le procédé d'électrofilage

Actuellement, des efforts considérables sont entrepris par les chercheurs afin de concevoir des matériaux d'emballages actifs, basés sur des technologies propres et respectueuses de l'environnement. L'objectif étant de satisfaire la demande des consommateurs pour des produits alimentaires sûrs, sains, pas ou peu transformés et sans conservateurs, avec la perspective de réduire le gaspillage et les intoxications alimentaire, essentiellement causés par le développement d'une flore d'altération et pathogène dans les aliments. Le chitosane est un polymère d'origine naturelle possédant de puissantes propriétés antimicrobiennes contre un large spectre de bactéries, levures et moisissures. L'inconvénient principal du chitosane est sa mauvaise aptitude à la mise en forme par les procédés industriels typiques des polymères. En effet, le chitosane étant un biopolymère thermosensible, et les procédés de mise en forme requérant des températures élevées, celui-ci se dégrade bien avant de fondre. Cette thèse vise donc à élaborer des matériaux antibactériens à base de chitosane par le procédé d'électrofilage. L'électrofilage du chitosane dans le but de préparer des nanofibres est un processus prometteur qui a suscité beaucoup d'intérêt durant les dernières années. Hormis leur biocompatibilité et leur activité bactéricide, les nanofibres de chitosane (CNFs) ainsi obtenues possèdent des propriétés très recherchées parmi lesquelles un faible diamètre (40 nm, proche de celui des fibres de collagène), une grande surface spécifique (jusqu'à 500 m2/g) et une importante porosité (~ 80 %). Le présent travail s'articule autour de trois grandes étapes. Étant donné que, pour être actives, les CNFs doivent être en contact direct avec l'aliment emballé, comprendre leur mécanisme d'action est alors crucial dans la lutte contre le gaspillage et les intoxications alimentaires. La première étape consiste donc à préparer les CNFs et à examiner leur mécanisme d'action antimicrobien in vitro, sur des souches bactériennes commensales et pathogènes les plus souvent incriminées dans l'altération microbiologique des aliments. L'activité bactéricide des CNFs a été investiguée contre deux bactéries à Gram négatif, Escherichia coli et Salmonella enterica serovar Typhimurium et deux bactéries à Gram positif, à savoir Staphylococcus aureus et Listeria innocua. La sensibilité/résistance des souches étudiées a été évaluée en termes de type de Gram, de l'hydrophobicité et de la densité de charge cellulaires de surface, mais aussi en fonction de la pathogénicité. Les résultats indiquent que l'activité antibactérienne des CNFs dépend de la protonation des groupements amines, et ce indépendamment du type bactérien. Le mode d'action des CNFs s'est révélé être bactéricide et non bactériostatique. Quant à la sensibilité des souches, celle-ci s'est avérée indépendante du type bactérien, tandis que l'hydrophobicité et la densité de charge de surface n'expliquent qu'en partie pour quoi certaines souches sont plus sensibles que d'autres à l'action des CNFs. L'ordre de sensibilité des souches était comme suit: E. coli > L. innocua > S. aureus > S. Typhimurium, les souches non pathogènes ou les moins virulentes étant les plus sensibles à l'action des CNFs. La deuxième étape étudie l'effet des CNFs sur l'intégrité de la membrane bactérienne. Les résultats montrent clairement que les CNFs, chargées positivement interagissent avec la paroi bactérienne, de charge opposée, induisant ainsi une déstabilisation de l'homéostasie de la cellule. Le mécanisme d'action des CNFs implique une perméabilisation de la membrane cellulaire. Le relargage du contenu cytosolique, incluant protéines, enzymes et ADN dans le milieu extracellulaire est une indication de la perméabilisation et perforation de la membrane plasmique, puisque la formation de pores a été observée en microscopie électronique à transmission. Dans la troisième et dernière étape, la préparation de matériaux d'emballage à base nanofibres de chitosane en vue d'une application concrète est investiguée. Pour ce faire, les solutions à base de chitosane ont été électrofilées sur la face interne d'un emballage conventionnel, en contact direct avec l'aliment à emballer. L'effet de la teneur en solvant et de l'ajout de faibles proportions d'oxyde de polyéthylène (PEO) sur l'élasticité, la densité de charge et la structure conformationnelle des chaînes de chitosane et son électrofilabilité ont d'abord été étudiés. Par la suite, l'efficacité bactéricide des emballages activés ainsi obtenus a été évaluée in vitro et dans des conditions réelles sur de la viande fraîche. Les résultats montrent qu'une bonne élasticité, atteinte à une teneur optimale en acide acétique de 50 % (v/v) et l'ajout de PEO à faible proportion (10-20 % p/p) facilitent la formation des nanofibres. Les résultats des tests in situ démontrent le potentiel prometteur (R = 95 %) des emballages à base de CNFs dans la lutte contre le gaspillage et les intoxications alimentaires d'origine bactériennes. De plus, l'allongement (d'une semaine) de la durée de vie de la viande fraîche est une propriété très recherchée dans l'industrie alimentaire et que les CNFs ont démontrée avec succès.

Abstract

Currently, considerable efforts are being undertaken by researchers to design active packaging materials on the basis of greener, cleaner and ecofriendly technologies. The goal is to satisfy consumers' demand for safe, healthy, unprocessed or minimally processed and preservative free food products, with the prospect of reducing food waste and poisoning, mainly caused by the development of alteration and pathogenic flora in food. Chitosan is a natural polymer exhibiting strong antimicrobial properties against a broad spectrum of bacteria, yeasts and molds. The main disadvantage of chitosan is its poor processability in typical industrial processes for polymers. Indeed, being a thermosensitive biopolymer while polymer processing requires high temperatures, chitosan thermally degrades before it melts. This thesis aims at developing chitosan-based antibacterial materials by the electrospinning process. Electrospinning of chitosan for the purpose of preparing nanofibers is a promising method that has attracted much interest in recent years. Besides their biocompatibility and bactericidal activity, the electrospun chitosan nanofibers (CNFs) exhibit highly desirable properties including a small diameter (40 nm, close to that of collagen fibers), a high surface area (up to 500 m2/g) and a high porosity (~ 80 %). The present work has focused on three main steps. Since in order to be active, CNFs must be in direct contact with the packaged food, understanding their mechanism of action is therefore crucial in the fight against food waste and poisoning. The first step was to prepare CNFs and examine their antimicrobial mechanism of action in vitro against commensal and pathogenic bacterial strains most often incriminated in microbiological alteration of food. The bactericidal activity of CNFs was investigated against two Gram-negative bacteria namely Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and two Gram-positive bacteria, Staphylococcus aureus and Listeria innocua. The susceptibility/resistance of the strains was evaluated in terms of Gram-type, cell surface hydrophobicity and charge density, as well as pathogenicity. The results indicated that the antibacterial activity of CNFs depends on the protonation of the amine groups, independently of bacterial type. The mode of action of CNFs revealed to be bactericidal and not bacteriostatic. Besides, the susceptibility of the strains was found to be independent of the Gram-type, while the hydrophobicity and the surface charge density explained only partly why some strains were more susceptible to the action of CNFs. The order of strain susceptibility was as follows: E. coli > L. innocua > S. aureus > S. Typhimurium, the non-pathogenic or least virulent strains being the most susceptible to the action of CNFs. The second step examines the effect of CNFs on the bacterial membrane integrity. The results clearly showed that the positively charged CNFs interact with the oppositely charged bacterial cell wall, thus inducing destabilization of the homeostasis of the cell. The mechanism of action of CNFs also involves permeabilization of the cell membrane. Moreover, the release of cytosolic compounds including proteins, enzymes and DNA in the extracellular medium, is an indication of the permeabilization and perforation of the plasma membrane, since pore formation was observed in transmission electron microscopy (TEM). In the third and last step, the preparation of CNF-based packaging (CNFP) materials as a concrete application was investigated. To do so, chitosan-based solutions were electrospun on top of the internal face of a conventional packaging, in direct contact with food. The effect of solvent strength as well as the addition of poly(ethylene oxide) (PEO) on the elasticity, charge density and conformational structure of chitosan chains and its electrospinnability was firstly studied. Thereafter, the bactericidal efficiency of the activated packaging was evaluated in vitro and under real conditions with fresh meat. The results show that a good elasticity, achieved at an optimum acetic acid content of 50 % (v/v) and by the addition of low proportions of PEO (10-20 wt %) facilitated the fiber formation process. The results of the in situ tests demonstrate the promising potential (R = 95%) of the CNFP in the fight against food waste and poisoning caused by bacterial contamination. In addition, the extension of the shelf-life (one week) of the tested fresh meat is a very sought-after property in the food industry and which CNFs have successfully demonstrated.