Développement de stratégies d'immobilisation du facteur de croissance endothélial vasculaire : contrôle de l'activité biologique pour le génie tissulaire

Un effort majeur de recherche est aujourd'hui porté sur le développement de nouvelles stratégies à base de matériaux synthétiques pour réparer ou remplacer des tissus endommagés, notamment pour le traitement des maladies cardiovasculaires – première cause de mortalité à l'échelle mondiale. Le défi majeur dans ce domaine est l'établissement d'un réseau vasculaire fonctionnel pour alimenter les cellules en oxygène et nutriments et éliminer les déchets métaboliques, condition sine qua non d'un tissu viable. Le réseau vasculaire chez l'Homme naît en effet d'un processus hautement complexe et finement régulé, et est sans cesse remodelé : sa conception in vitro en est d'autant plus ardue. Parmi les nombreux effecteurs biologiques responsables de l'angiogenèse, le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) apparaît comme un acteur primordial. Il est en effet le principal médiateur du comportement des cellules endothéliales – ces dernières étant au coeur du développement primaire des vaisseaux et assurant le rôle critique d'interface entre le tissu et le sang. Des études de longue haleine menées sur l'angiogenèse ont ainsi mis en évidence l'ubiquité de VEGF dans ces processus, une présence incontournable mais surtout contrôlée, en termes de concentration, de présentation et même de forme. Afin de permettre au génie tissulaire de progresser, une hypothèse biologique a été formulée dans le cadre de cette thèse : le développement de l'angiogenèse thérapeutique requiert l'imitation des processus physiologiques pour contrôler la présentation de VEGF, en particulier vis-à-vis de sa stabilité sur le support et de sa capacité à être internalisé. La validation de cette hypothèse nécessite quant à elle une plateforme adéquate pour mener les essais, et parmi les technologies existantes, notre attention s'est portée sur les interactions superhélices, soit un système moléculaire d'attache très documenté qui comprend deux peptides complémentaires capables de s'auto-assembler. Une seconde hypothèse, d'ordre technologique cette fois, a ainsi été formulée : le système superhélice permet d'immobiliser VEGF sur un substrat solide et de contrôler sa présentation et sa stabilité. Plus précisément, un objectif a été défini quant à la gamme d'affinités à couvrir, soit entre 107 et 1011 M-1. Nous avons, dans un premier temps, validé l'emploi d'un premier système superhélice basé sur les peptides (EVSALEK)5 et (KVSALKE) 5, ou E5 et K5, pour immobiliser VEGF. Pour ce faire, une chimère E5-VEGF a été produite et caractérisée : son immobilisation a été confirmée par test ELISA et son activité biologique démontrée via la promotion de la survie de cellules endothéliales modèles. Ces résultats, rapportés dans le Chapitre 4, constituent notre premier manuscrit, publié dans le journal Acta Biomaterialia. De façon intéressante, l'immobilisation d'E5-VEGF sur des surfaces présentant le peptide complémentaire K5 a été confirmée au moyen de tests avec un biocapteur à résonance plasmonique de surface (SPR). Au cours de ces derniers, la stabilité de la protéine immobilisée est apparue très haute : aucune dissociation du complexe n'a été observée, et il n'a pas été possible de régénérer les surfaces. La régulation que nous souhaitions mettre en place touche majoritairement à la libération contrôlée du facteur de croissance, c'est pourquoi d'autres couples de peptides formant des interactions superhélices ont été étudiés. En collaboration avec le professeur Hodges de l'Université du Colorado, trois peptides analogues du peptide K5 ont été conçus et caractérisés finement avec un biocapteur SPR. La capacité des trois nouveaux peptides à capturer E5-VEGF a été confirmée, et les substitutions de résidus – choisies pour déstabiliser le coeur hydrophobe des superhélices – ont permis de diminuer la stabilité de la protéine immobilisée. Plusieurs essais menés avec d'autres molécules porteuses d'une ou plusieurs étiquettes E5 ont permis d'identifier les couples couvrant la gamme d'affinités voulue. Ces résultats constituent le second manuscrit, présenté dans le Chapitre 5 et publié dans le journal Biomacromolecules. Les essais SPR et les tests ELISA réalisés ont mené à une découverte fortuite : la protéine chimère E5-VEGF présente une propension forte à s'adsorber sur certains substrats ne présentant pas le peptide complémentaire K5. Une étude approfondie, présentée dans le Chapitre 6 et publiée dans le journal Biomacromolecules, a permis de déterminer les forces sous-jacentes à ce phénomène. La caractérisation et l'optimisation de cette adsorption spécifique par l'étiquette E5 a de plus rendu possible un contrôle relatif de la vitesse de la libération contrôlée, sans affecter la bioactivité du facteur de croissance (démontrée dans des essais de prolifération de cellules endothéliales). Il en ressort une nouvelle stratégie d'immobilisation de VEGF, simplifiée, accélérée et relativement stable, qui présente un fort potentiel pour de nombreuses applications en médecine régénératrice. Les travaux présentés dans les manuscrits associés à cette thèse valident l'hypothèse technologique formulée sur les interactions superhélices. En outre, de nombreux résultats complémentaires, réalisés en collaboration directe avec plusieurs collègues au sein du groupe de recherche, ont permis de développer une plateforme qui permet d'immobiliser E5-VEGF avec un contrôle fin, tant sur la densité surfacique que sur la spécificité du greffage par interactions superhélices (l'adsorption directe étant fortement inhibée). Ce substrat adéquat pourra être mis à profit pour étudier la réponse de cellules endothéliales à E5-VEGF immobilisé via les 4 peptides analogues – un plan d'expériences détaillé est suggéré dans le Chapitre 7 de cette thèse. Succinctement, la validation de l'hypothèse biologique nécessitera de caractériser l'internalisation de VEGF et de ses récepteurs et de l'associer à la réponse cellulaire – tant au niveau des voies de signalisation activées que vis-à-vis du comportement macroscopique (migratoire, prolifératif, etc.). En outre, les technologies développées pourront être mises à profit pour d'autres applications dans le domaine de la médecine régénératrice et du génie tissulaire, ou en combinaison avec d'autres facteurs de croissances et biomolécules, pour l'encapsulation de médicaments ou encore la thérapie génique.