Développement de stratégies d'immobilisation du facteur de croissance endothélial vasculaire : contrôle de l'activité biologique pour le génie tissulaire

Un effort majeur de recherche est aujourd'hui porté sur le développement de nouvelles stratégies à base de matériaux synthétiques pour réparer ou remplacer des tissus endommagés, notamment pour le traitement des maladies cardiovasculaires – première cause de mortalité à l'échelle mondiale. Le défi majeur dans ce domaine est l'établissement d'un réseau vasculaire fonctionnel pour alimenter les cellules en oxygène et nutriments et éliminer les déchets métaboliques, condition sine qua non d'un tissu viable. Le réseau vasculaire chez l'Homme naît en effet d'un processus hautement complexe et finement régulé, et est sans cesse remodelé : sa conception in vitro en est d'autant plus ardue. Parmi les nombreux effecteurs biologiques responsables de l'angiogenèse, le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) apparaît comme un acteur primordial. Il est en effet le principal médiateur du comportement des cellules endothéliales – ces dernières étant au coeur du développement primaire des vaisseaux et assurant le rôle critique d'interface entre le tissu et le sang. Des études de longue haleine menées sur l'angiogenèse ont ainsi mis en évidence l'ubiquité de VEGF dans ces processus, une présence incontournable mais surtout contrôlée, en termes de concentration, de présentation et même de forme. Afin de permettre au génie tissulaire de progresser, une hypothèse biologique a été formulée dans le cadre de cette thèse : le développement de l'angiogenèse thérapeutique requiert l'imitation des processus physiologiques pour contrôler la présentation de VEGF, en particulier vis-à-vis de sa stabilité sur le support et de sa capacité à être internalisé. La validation de cette hypothèse nécessite quant à elle une plateforme adéquate pour mener les essais, et parmi les technologies existantes, notre attention s'est portée sur les interactions superhélices, soit un système moléculaire d'attache très documenté qui comprend deux peptides complémentaires capables de s'auto-assembler. Une seconde hypothèse, d'ordre technologique cette fois, a ainsi été formulée : le système superhélice permet d'immobiliser VEGF sur un substrat solide et de contrôler sa présentation et sa stabilité. Plus précisément, un objectif a été défini quant à la gamme d'affinités à couvrir, soit entre 107 et 1011 M-1. Nous avons, dans un premier temps, validé l'emploi d'un premier système superhélice basé sur les peptides (EVSALEK)5 et (KVSALKE) 5, ou E5 et K5, pour immobiliser VEGF. Pour ce faire, une chimère E5-VEGF a été produite et caractérisée : son immobilisation a été confirmée par test ELISA et son activité biologique démontrée via la promotion de la survie de cellules endothéliales modèles. Ces résultats, rapportés dans le Chapitre 4, constituent notre premier manuscrit, publié dans le journal Acta Biomaterialia. De façon intéressante, l'immobilisation d'E5-VEGF sur des surfaces présentant le peptide complémentaire K5 a été confirmée au moyen de tests avec un biocapteur à résonance plasmonique de surface (SPR). Au cours de ces derniers, la stabilité de la protéine immobilisée est apparue très haute : aucune dissociation du complexe n'a été observée, et il n'a pas été possible de régénérer les surfaces. La régulation que nous souhaitions mettre en place touche majoritairement à la libération contrôlée du facteur de croissance, c'est pourquoi d'autres couples de peptides formant des interactions superhélices ont été étudiés. En collaboration avec le professeur Hodges de l'Université du Colorado, trois peptides analogues du peptide K5 ont été conçus et caractérisés finement avec un biocapteur SPR. La capacité des trois nouveaux peptides à capturer E5-VEGF a été confirmée, et les substitutions de résidus – choisies pour déstabiliser le coeur hydrophobe des superhélices – ont permis de diminuer la stabilité de la protéine immobilisée. Plusieurs essais menés avec d'autres molécules porteuses d'une ou plusieurs étiquettes E5 ont permis d'identifier les couples couvrant la gamme d'affinités voulue. Ces résultats constituent le second manuscrit, présenté dans le Chapitre 5 et publié dans le journal Biomacromolecules. Les essais SPR et les tests ELISA réalisés ont mené à une découverte fortuite : la protéine chimère E5-VEGF présente une propension forte à s'adsorber sur certains substrats ne présentant pas le peptide complémentaire K5. Une étude approfondie, présentée dans le Chapitre 6 et publiée dans le journal Biomacromolecules, a permis de déterminer les forces sous-jacentes à ce phénomène. La caractérisation et l'optimisation de cette adsorption spécifique par l'étiquette E5 a de plus rendu possible un contrôle relatif de la vitesse de la libération contrôlée, sans affecter la bioactivité du facteur de croissance (démontrée dans des essais de prolifération de cellules endothéliales). Il en ressort une nouvelle stratégie d'immobilisation de VEGF, simplifiée, accélérée et relativement stable, qui présente un fort potentiel pour de nombreuses applications en médecine régénératrice. Les travaux présentés dans les manuscrits associés à cette thèse valident l'hypothèse technologique formulée sur les interactions superhélices. En outre, de nombreux résultats complémentaires, réalisés en collaboration directe avec plusieurs collègues au sein du groupe de recherche, ont permis de développer une plateforme qui permet d'immobiliser E5-VEGF avec un contrôle fin, tant sur la densité surfacique que sur la spécificité du greffage par interactions superhélices (l'adsorption directe étant fortement inhibée). Ce substrat adéquat pourra être mis à profit pour étudier la réponse de cellules endothéliales à E5-VEGF immobilisé via les 4 peptides analogues – un plan d'expériences détaillé est suggéré dans le Chapitre 7 de cette thèse. Succinctement, la validation de l'hypothèse biologique nécessitera de caractériser l'internalisation de VEGF et de ses récepteurs et de l'associer à la réponse cellulaire – tant au niveau des voies de signalisation activées que vis-à-vis du comportement macroscopique (migratoire, prolifératif, etc.). En outre, les technologies développées pourront être mises à profit pour d'autres applications dans le domaine de la médecine régénératrice et du génie tissulaire, ou en combinaison avec d'autres facteurs de croissances et biomolécules, pour l'encapsulation de médicaments ou encore la thérapie génique.

Abstract

In order to repair or replace damaged tissues, notably for the treatment of cardiovascular diseases – the world-leading cause of death, great effort is currently spent on the development of new strategies that are based on synthetic materials. The major challenge in that endeavour is to establish a functional vasculature that provides oxygen and nutrients to the cells while removing metabolic waste. Although this is a prerequisite to obtain a sustainable tissue, its conception in vitro has proven to be arduous. The human vascular network indeed expands via a highly complex and finely tuned process, after which it keeps being remodeled. Endothelial cells play a major role in this expansion: they drive blood vessel formation and ensure the integrity of the blood-tissue interface. Their behaviour being predominantly controlled by the vascular endothelial growth factor (VEGF), this growth factor stands out as the main biological effector of angiogenesis. Numerous studies of the angiogenic process have demonstrated the ubiquitous role of VEGF as well as the importance of its spatiotemporal control, be it in terms of concentration, presentation or form. So as to foster advances in tissue engineering, we first formulated a biological hypothesis: the physiological processes that regulate VEGF presentation need to be mimicked for therapeutic angiogenesis to advance, in particular regarding the stability of immobilized VEGF and its capacity to be internalized. The validation of this hypothesis requires the development of an adequate test platform and, among existing technologies, our attention was drawn to coiled-coil interactions. The coiled-coil motif is indeed a well-documented molecular structure obtained by auto-assembly of two complementary peptides. A second hypothesis, of technological nature, was thus formulated: coiled-coil interactions enable the surface immobilization of VEGF that can be controlled in terms of presentation and stability. More precisely, an affinity range spanning from 107 to 1011 M-1, was determined to be of prime interest. To begin with, we have chosen a first coiled-coil motif based on the interaction between the two peptides (EVSALEK)5 and (KVSALKE) 5, or E5 et K5, and confirmed that it enabled VEGF immobilization. This was achieved by producing an E5-tagged VEGF chimera (E5-VEGF) and characterizing its grafting by immunosorbent assays (ELISA). Its biological activity was also demonstrated via model endothelial cell survival assays. The results, which are presented in Chapitre 4, were compiled into the first manuscript, published in Acta Biomaterialia. It is here worth noticing that E5-VEGF capture on K5-decorated surfaces was further supported using a surface plasmon resonance (SPR)-based biosensor and was shown to be highly stable: there was no detectable dissociation of the complex and the surfaces could not be regenerated. The level of stability we sought for VEGF being closer to controlled release than immutable immobilization, new coiled-coil-forming peptide couples were developed. In partnership with Prof. Hodges at University of Colorado, three peptides were designed as analogues to the peptide K5 and thoroughly characterized using an SPR-based biosensor. Their ability to capture E5-VEGF was confirmed. Moreover, the residue substitutions, which were designed to destabilize the hydrophobic core of the coiled-coil, successfully diminished the stability of immobilized VEGF. A series of assays were carried out with other biomolecules bearing one or more E5 tags, and several peptide couples were identified that enable the coverage of the desired affinity range. The results comprise the second manuscript of the thesis that is presented in Chapitre 5 and was published in Biomacromolecules. The various ELISA and SPR assays led to a fortuitous discovery: the chimeric E5-VEGF protein presented a strong propensity to adsorb on certain substrates that were not decorated with the complementary K5. The driving forces of the E5-tag-mediated adsorption process were thoroughly characterized, and the biological activity of adsorbed E5-VEGF was confirmed via endothelial cell proliferation assays. Moreover, a relative control on the release rate of the growth factor was achieved. The data are presented in Chapitre 6 and were compiled in an article that was published in Biomacromolecules. Altogether, this study has unveiled a new immobilization strategy for VEGF that is fast, readily implemented and quite stable, thus bearing strong potential for numerous applications in regenerative medicine. The work that was performed during the thesis validates the technological hypothesis that we formulated regarding coiled-coil interactions. Moreover, an adequate test platform for the subsequent study – featuring fine control over surface density and capture specificity of E5-VEGF – was developed through a number of complementary experiments that were carried out in partnership with several colleagues. The substrate in question will prove beneficial to investigate endothelial cell response to E5-VEGF when immobilized via K5 and its three analogues. A detailed design of experiments is suggested in Chapitre 7 so as to validate the biological hypothesis of the thesis. Briefly, this will require a refined characterization of the internalization of VEGF and its cognate receptors, in correlation with cell response, regarding both the activation of signaling pathways and the macroscopic behaviour (migration, proliferation, etc.). Furthermore, the technological tools we here present could be utilized for a number of other applications in the tissue engineering and regenerative medicine field, be it in conjunction with other growth factors or biomolecules, for drug encapsulation or even gene therapy.