Caractérisation des plasmides recombinants exprimant trois formes de récepteurs TNFR bioactifs capables d'inhiber, in vitro, l'effet de la cytokine pro-inflammatoire TNFα

L'arthrose rhumatoïde est une maladie inflammatoire auto-immune. Elle provoque une inflammation chronique des articulations et des os qui conduisent à une destruction progressive de ces derniers. Cette maladie affecte 0.5 à 1 % de la population des pays industrialisés et impose des coûts importants au système de santé. La société canadienne de l'arthrose rapporte que 6 % des hospitalisations totales au Canada sont imputables à l'arthrite. La cytokine TNFα joue un rôle important dans le processus inflammatoire lié à l'arthrose de ce fait la neutralisation et/ou l'inhibition de la surexpression de cette cytokine est une cible prometteuse pour le traitement de l'arthrose rhumatoïde. Il existe plusieurs molécules biologiques bloquant la cytokine TNFα, utilisées avec grand succès pour le traitement de l'arthrose tel que l'anticorps monoclonal anti TNFα Infliximab et le récepteur soluble TNFRII Etanercept. Cependant la durée de vie de ses protéines en circulation est faible et peut nécessiter une augmentation des doses et des injections, avec le risque d'augmentation de la toxicité de ses protéines. Ces inconvénients associés à cette approche thérapeutique peuvent être contournés par une approche de thérapie génique qui permet une production stable de la protéine dans le temps et une expression localisée du transgène. Notre objectif est, en choisissant le rat comme modèle animal de l'arthrose rhumatoïde, de construire des plasmides recombinants contenant des transgènes codant pour des protéines recombinantes correspondantes au récepteur soluble du TNFα capables de bloquer le TNFα. Les plasmides recombinants sont livrés in vitro aux cellules à l'aide d'un système de livraison polymérique, le chitosane. Le chitosane s'est avéré le système de livraison idéal pour la protection de L'ADN plasmidique contre la dégradation par les nucléases et pour leur livraison au niveau du cytosol. Nous avons donc construit trois transgènes codant pour des protéines mimant le récepteur soluble du TNFα du rat. Le premier (TNFR) code pour la partie extracellulaire soluble du récepteur TNFRII. Le second (IgTNFR) code pour la partie extracellulaire soluble du récepteur TNFRII couplé à la séquence codante pour les régions CH2 et CH3 de la partie constante d'une immunoglobuline de type G1 (IgG1) du rat excluant la région charnière. Le troisième (IgTNFRd) composé de la partie extracellulaire soluble du récepteur TNFRII couplée à la séquence codante pour les régions CH2 et CH3 de la partie constante d'un IgG du rat incluant la région charnière. La région charnière permet la dimérisation via pont disulfure de l'anticorps et donc de la protéine recombinante IgTNFRd. Le vecteur d'expression eucaryotique pVax1 sécuritaire et approuvé par la FDA (food and drugs administation) a été utilisé pour l'expression de nos trois transgènes.

Abstract

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease that affects joints and leads to gradual destruction of bones and articulations. RA affects 0.5 to 1 % of the population in industrial countries and imposes considerable cost on the healthcare system. According to The Arthritis Society 6 % of total hospitalization in Canada are due to arthritis. The tumor necrosis factor (TNF), a proinflammatory cytokine, plays a key role in the pathogenesis of RA and a lot of drugs targeting this molecule have emerged to treat RA. These molecules such as anti-TNF monoclonal antibody or soluble TNF receptor II, Etanercept, are currently in use to treat RA with success. However, this molecule have some limitation, their half-life is short in circulation requiring high doses and multiple injections which increases their risk to different infections. This limitation can be overcome by gene therapy based strategy. Gene therapy allows a stable and localized production of the therapeutic transgene. Our goal was to design and construct three recombinant plasmids encoding soluble TNF receptors capable of inhibiting TNF in solution. The first recombinant plasmid, TNFR encodes for the extracellular region of the rat TNF receptor II. The second recombinant plasmid, IgTNFR encodes for the extracellular region of the rat TNF receptor II merged to the CH2 and CH3 regions of the constant region of rat immunoglobulin G1 without the hinge region. The third recombinant plasmid, IgTNFRd encodes for the extracellular region of the rat TNF receptor II merged to the CH2 and CH3 regions of the constant region of rat immunoglobulin G1 including the hinge region. The hinge region is responsible for antibody dimerization by disulfure bond. The safe and FDA (food and drugs administration) approved eukaryote plasmid, pVax was selected as expressing vector of the three transgenes. The recombinant plasmids are complexed with the polymeric carrier chitosan to form chitosan-based nanoparticles that protect plasmid DNA against digestion by nucleases until their delivery to the cytosol. The formulation of chitosan 92-10-5 (degree of deacetylation- molecular weight- ratio nitrogen: phosphate) was used to complex recombinant pDNA to form nanoparticles. These nanoparticles were characterized using techniques of electron microscope (ESEM) and dynamic light scattering (DLS). These two techniques showed nanoparticles with spherical and cylindrical shapes with an average diameter of 95 nm and a zeta potential of 30 mV. During this research project, we have clearly demonstrated the capacity of chitosan to protect the plasmid DNA against nuclease digestion at supraphysiological concentrations with the detection of transgene-specific mRNA specific transgene in HEK293 and CHO transfected cell lines.