Perméabilisation de membranes cellulaires à l'aide d'un laser nanoseconde amplifié par nanoparticules plasmoniques

The plasmic membrane of eukaryot cells provides a selective permeability between the cytoplasm and the external environment. It regulates the passage of ions (O2, N2, K, etc...) and molecules (H2O, C2H6O, etc...) by mechanisms like passive di↵usion and active transport. In various fields like molecular biology or drug development, it is sometimes needed to bypass this selective permeability to introduce external molecules that are normally impermeable to cell membrane. Examples of external molecules may be DNA plasmid, RNA segment or drugs. We propose a method based on laser amplification by plasmonic nanoparticles to overcome this biological barrier. This non invasive method increases the membrane permeability of a large number of cells in a short time. Optoporation by laser amplified with plasmonic nanoparticles consists of pulsed laser irradiation on cells that have been previously incubated with gold nanoparticles (AuNPs). The laser-AuNPs interactions will create a cavitation bubble which in turn will decrease the membrane permeability by disrupting the bilipid layer arrangement. Molecules in the external medium may then penetrate inside the cells and under the right experimental conditions, the cells will rapidly reseal their membrane and continue living without nefast e↵ects. The feasibility of high throughput optical perforation amplified by plasmonic nanoparticles have been tested with a nanosecond pulsed laser working at 532 nm and 1064 nm. The plasma membrane of cancerous human fibroblast (melanoma wm278) have been successfully perforated while keeping an excellent viability rate. Up to 30% of cells are perforated in which the Lucifer Yellow fluorophore have been incorporated. The viability 2 h after the treatment was evaluated by PI exclusion and the long term vitality was tested by MTT essay. Under optimal conditions at 532 nm, the 2 h viability is 84% and the vitality start at 64% for 2h and reaches 88% after 72 h. With 1064 nm pusles, the 2 h viability is situated at 85% and vitality goes from 81% at 2h to 99% 72 h after experiment. The AuNPs size were examined to determine if any transformation occurred upon irradiation. This was verified by spectroscopic measurements as well as SEM images. Gold nanoparticles undergo rapid transformation upon irradiation but the 5 pulses delivered during the treatment prove to be insufficient to damage the nanoparticles.

Résumé

La membrane plasmique des cellules eucaryotes assure une perméabilité sélective entre le cytoplasme et le milieu extérieur. Elle régule l'entrée et la sortie des ions (O2, N2, K, etc..) et des molécules (eau, éthanol, etc..) nécessaires à son bon fonctionnement par des mécanismes de diffusion ou de transport actif. Dans des domaines tels que la biologie moléculaire ou le développement de nouveaux traitements, il est parfois souhaitable de contourner cette perméabilité sélective afin d'insérer à l'intérieur des cellules des molécules qui y sont normalement imperméables. Ces molécules peuvent être des plasmides d'ADN, des ARN, ou différents médicaments. Afin de surmonter cette barrière biologique, nous proposons l'optoporation à l'aide d'un laser amplifié par nanostructures plasmoniques. Cette technique non invasive permet d'augmenter la perméabilité membranaire d'un grand volume de cellules en peu de temps. L'optoporation à l'aide d'un laser amplifié par nanostructures plasmoniques correspond à une irradiation par laser pulsé sur des cellules préalablement incubées avec des nanoparticules d'or (AuNPs). L'interaction laser-AuNP crée une bulle de cavitation qui permet d'augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire en perturbant l'organisation de ses éléments bilipidiques. Des molécules en suspension dans le milieu externe peuvent ensuite pénétrer à l'intérieur de la cellule par diffusion. Sous les conditions propices, l'intégrité de la membrane sera rapidement retrouvée et la cellule sera peu affectée. La faisabilité de cette technique de perméabilisation a été testée avec un laser à impulsions nanosecondes opérant à 532 nm et à 1064 nm. La membrane plasmique de fibroblastes cancéreux humains (mélanômes wm278) a été perforée avec succès tout en conservant une excellente viabilité cellulaire. Le fluorophore Lucifer Yellow (LY) a été incorporé à l'intérieur de 30% des cellules irradiées. La viabilité 2 h après la traitement a été évaluée par exclusion d'iodure de propidium (IP) tandis que la vitalité des cellules à long terme a été évaluée à l'aide de tests MTT. Sous les conditions optimales, à 532 nm, la viabilité est de 84% après 2h (exclusion IP) et la vitalité passe de 64% (2h) à 88% après 72 h (MTT). À 1064 nm, la viabilité atteint 85% et la vitalité se situe entre 81% et 99% entre 2 et 72 h. Les dimensions des AuNPs après irradiation ont également été examinées afin de déterminer si elles avaient subi des transformations durant le traitement. Pour ce faire, des mesures spectroscopiques ainsi que des images au MEB ont été réalisées. Une réduction de taille est observée après quelque secondes d'irradiation mais les quelques impulsions livrées lors du traitement ne sont pas suffisants pour transformer significativement les NPs.