Étude du comportement de cellules endothéliales de l'aorte cultivées sur des fibres électrofilées de PET sous conditions physiologiques de cisaillement

For around 50 years, tissue engineering techniques have been explored to create new alternatives
for the treatment of atherosclerosis. In the past years, hybrid structures made of polymers and
cells have attracted most of the community's attention for its expected capacity to mimic the
biological context of blood vessels. A variety of synthetic and natural polymers have been used to
create biostable scaffolds that allow cell growth. Standard cell culture techniques and protocols
have been adapted, with the objective to preserve and maintain the viability and phenotype of the
cells, when cultured on these polymeric structures in vitro. However, the response of the immune
system to invasive devices, the absence of a healthy grown endothelium and the lack of adequate
mechanical properties of the materials limited the the long term success of the grafts.
Trombogenicity and compliance mismatch are still two common unsolved problems following
the transplant of small diameter vascular replacements, normally leading to imminent graft
failure.
The present master's study started from the statement that non-woven structures, with fiber
diameter at the nano-scale size, might enhance cell growth and adherence under both static and
dynamic conditions. Therefore, a novel non-woven nano-PET structure, obtained by
electrospinning, was used to grow HAoEC and cell response was characterized under shear stress
conditions. The objective was to characterize the effects of submitting adhered cells to a
physiological shear stress for different periods of time on cell adherence, as well as the cell
cytoskeleton and junctions between cells. A parallel plate flow chamber was used and modified
in order to cope with specific constraints of using a mat. Assays were classified in two groups:
short (20 min) and long-term (6 and 12 h), monitoring cell adherence as well as the distribution
of actin filaments and the expression of VE-cadherin. Results showed that short-term exposures
did not affect cell adherence (~100%), maintaining a uniform endothelium, even under the
exposure of extreme conditions of shear stress (26 dyn cm-2). On the other hand, long–term
exposure times resulted in the disruption of the endothelium, with 35% of cell detaching after 6 h
and 70% after 12 h. However, the observations over time showed that cells tried to adapt to the
abrupt change in shear stress, adopting different morphologies and shapes, and creating strong
bonds between them.

Résumé

Depuis près de 50 ans, des techniques de génie tissulaire ont été développées afin de créer des
alternatives efficaces au traitement de l'athérosclérose. Aussi, ces dernières années, les structures
hybrides faites de biopolymères et de cellules ont particulièrement attiré l'attention de la
communauté pour leur capacité à mimer la réalité biologique des vaisseaux sanguins. Une variété
de polymères synthétiques et naturels ont été déjà utilisés pour créer des greffons biocompatibles
et biostables, permettant la croissance cellulaire. Les pratiques de culture cellulaire in vitro
courantes ont pu être adaptées à la réalité d'une croissance sur biomatériaux, avec l'objectif de
préserver et de maintenir la viabilité ainsi que le phénotype des cellules en contact avec ces
biomatériaux. Cependant, la réponse immunitaire engendrée par l'introduction de ces
biomatériaux, le manque de croissance d'un endothélium viable sur les structures synthétiques, et
l'absence de propriétés mécaniques adéquates des matériaux, limitent le temps de vie des
greffons vasculaires après la transplantation. De plus, des problèmes de thrombogénicité et
d'adaptation élastique sont encore observés lors de remplacements vasculaires de petit diamètre,
ce qui menant à un échec éventuel des greffons.
La présente étude est donc basée sur l'utilisation de structures polymériques non-tissées, au
diamètre de fibres nanométrique, dont on suggère qu'elles pourraient améliorer la croissance et
l'adhérence des cellules sous des conditions statiques et dynamiques. Ainsi, une nouvelle
structure nanométrique non-tissée de polyéthylène téréphtalate (PET) fabriquée par la technique
d'électrofilage et récemment mise au point par le groupe de recherche, a été utilisée pour
supporter la formation in vitro d'un endothélium par culture de cellules endothéliales de l'aorte
d'origine humaine (HAoEC). L'objectif de ce projet de maîtrise a consisté en la caractérisation de
l'adhérence cellulaire sous conditions de stress hydrodynamiques. La réponse morphologique des
cellules a été caractérisée par l'observation de l'évolution du cytosquelette et des liaisons
intercellulaires, sous des conditions de cisaillement physiologique. Des essais en conditions
dynamiques ont été effectués en chambre de culture permettant l'imposition d'un flux laminaire,
par alimentation d'un milieu de culture oxygéné. Les tests ont été classifiés en deux groupes :
« court terme », pour une durée de 20 min, et « long terme » sur des durées de 6 et 12 h. La
distribution des filaments d'actine et les liaisons entre les cellules, évaluée selon le niveau