Étude du comportement de cellules endothéliales de l'aorte cultivées sur des fibres électrofilées de PET sous conditions physiologiques de cisaillement

For around 50 years, tissue engineering techniques have been explored to create new alternatives for the treatment of atherosclerosis. In the past years, hybrid structures made of polymers and cells have attracted most of the community's attention for its expected capacity to mimic the biological context of blood vessels. A variety of synthetic and natural polymers have been used to create biostable scaffolds that allow cell growth. Standard cell culture techniques and protocols have been adapted, with the objective to preserve and maintain the viability and phenotype of the cells, when cultured on these polymeric structures in vitro. However, the response of the immune system to invasive devices, the absence of a healthy grown endothelium and the lack of adequate mechanical properties of the materials limited the the long term success of the grafts. Trombogenicity and compliance mismatch are still two common unsolved problems following the transplant of small diameter vascular replacements, normally leading to imminent graft failure. The present master's study started from the statement that non-woven structures, with fiber diameter at the nano-scale size, might enhance cell growth and adherence under both static and dynamic conditions. Therefore, a novel non-woven nano-PET structure, obtained by electrospinning, was used to grow HAoEC and cell response was characterized under shear stress conditions. The objective was to characterize the effects of submitting adhered cells to a physiological shear stress for different periods of time on cell adherence, as well as the cell cytoskeleton and junctions between cells. A parallel plate flow chamber was used and modified in order to cope with specific constraints of using a mat. Assays were classified in two groups: short (20 min) and long-term (6 and 12 h), monitoring cell adherence as well as the distribution of actin filaments and the expression of VE-cadherin. Results showed that short-term exposures did not affect cell adherence (~100%), maintaining a uniform endothelium, even under the exposure of extreme conditions of shear stress (26 dyn cm-2). On the other hand, long–term exposure times resulted in the disruption of the endothelium, with 35% of cell detaching after 6 h and 70% after 12 h. However, the observations over time showed that cells tried to adapt to the abrupt change in shear stress, adopting different morphologies and shapes, and creating strong bonds between them.

Résumé

Depuis près de 50 ans, des techniques de génie tissulaire ont été développées afin de créer des alternatives efficaces au traitement de l'athérosclérose. Aussi, ces dernières années, les structures hybrides faites de biopolymères et de cellules ont particulièrement attiré l'attention de la communauté pour leur capacité à mimer la réalité biologique des vaisseaux sanguins. Une variété de polymères synthétiques et naturels ont été déjà utilisés pour créer des greffons biocompatibles et biostables, permettant la croissance cellulaire. Les pratiques de culture cellulaire in vitro courantes ont pu être adaptées à la réalité d'une croissance sur biomatériaux, avec l'objectif de préserver et de maintenir la viabilité ainsi que le phénotype des cellules en contact avec ces biomatériaux. Cependant, la réponse immunitaire engendrée par l'introduction de ces biomatériaux, le manque de croissance d'un endothélium viable sur les structures synthétiques, et l'absence de propriétés mécaniques adéquates des matériaux, limitent le temps de vie des greffons vasculaires après la transplantation. De plus, des problèmes de thrombogénicité et d'adaptation élastique sont encore observés lors de remplacements vasculaires de petit diamètre, ce qui menant à un échec éventuel des greffons. La présente étude est donc basée sur l'utilisation de structures polymériques non-tissées, au diamètre de fibres nanométrique, dont on suggère qu'elles pourraient améliorer la croissance et l'adhérence des cellules sous des conditions statiques et dynamiques. Ainsi, une nouvelle structure nanométrique non-tissée de polyéthylène téréphtalate (PET) fabriquée par la technique d'électrofilage et récemment mise au point par le groupe de recherche, a été utilisée pour supporter la formation in vitro d'un endothélium par culture de cellules endothéliales de l'aorte d'origine humaine (HAoEC). L'objectif de ce projet de maîtrise a consisté en la caractérisation de l'adhérence cellulaire sous conditions de stress hydrodynamiques. La réponse morphologique des cellules a été caractérisée par l'observation de l'évolution du cytosquelette et des liaisons intercellulaires, sous des conditions de cisaillement physiologique. Des essais en conditions dynamiques ont été effectués en chambre de culture permettant l'imposition d'un flux laminaire, par alimentation d'un milieu de culture oxygéné. Les tests ont été classifiés en deux groupes : « court terme », pour une durée de 20 min, et « long terme » sur des durées de 6 et 12 h. La distribution des filaments d'actine et les liaisons entre les cellules, évaluée selon le niveau