Silençage génique de l'ARNm codant pour l'apolipoprotéine B après administration par voie intraveineuse de nanoparticules chitosane/siARN-ApoB dans un modèle murin d'athérosclérose

L'athérosclérose est une maladie inflammatoire auto-suffisante dont le développement progressif asymptomatique mène à la majorité des maladies cardiovasculaires causant approximativement 75 000 décès par année au Canada seulement. L'apolipoprotéine B (ApoB) est une composante structurelle essentielle des lipoprotéines de faible densité (LDL), responsables de l'initiation et du développement de l'athérosclérose. Les médicaments actuels ne font que ralentir le développement athérosclérotique au lieu d'atteindre la source du problème qui est principalement l'ApoB. D'où l'importance de trouver une nouvelle avenue biomédicale telle que le silençage génique de l'ApoB en utilisant un système conçu pour livrer systémiquement des petits ARN interférents (siARN) et pour les libérer dans des cellules « cibles ». Nous avons donc pour hypothèse de recherche que l'administration par voie intraveineuse des nanoparticules chitosane/siARN-ApoB est en mesure d'induire des effets thérapeutiques sécuritaires dans un modèle murin d'athérosclérose. Le chitosane est un polymère cationique, naturel et biodégradable dont les caractéristiques intrinsèques varient en fonction de son degré de désacétylation (DD) et sa masse moléculaire (MM). De plus, le ratio amine de chitosane : phosphate de siARN (N:P) utilisé pour former les nanoparticules, ainsi que le DD et la MM du chitosane influencent grandement les caractéristiques physico-chimiques des nanoparticules. Les formulations de chitosane (DD-MM-N:P) utilisées dans le cadre de ce projet, soit le 92-10-5, le 80-80-5 et le 80-10-10 ont été préalablement évaluées en thérapie génique. Les analyses par microscopie électronique à balayage environnemental (ESEM) et par diffusion dynamique de la lumière (DLS) ont démontré que les nanoparticules chitosane/oligonucléotides double brin (ODNdb)-ApoB sphériques et homogènes possèdent des tailles et des potentiels zêta (δ) variant entre 41 et 108 nm et entre 15 et 23 mV, respectivement. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide a démontré la stabilité des nanoparticules chitosane/ODNdb-ApoB formées de chitosane 92-10 à divers ratios N:P lors d'incubation à différentes périodes dans des solutions de pH différents. Nous avons également démontré par électrophorèse sur gel d'agarose que le chitosane est en mesure de protéger efficacement les ODNdb-ApoB contre la dégradation à des concentrations supra-physiologiques de désoxyribonucléases I (ADNase I) (2 unités d'ADNase I/μg d'ODNdb).

Abstract

Atherosclerosis is a self-sufficient inflammatory disease whose asymptomatic progressive development leads to the majority of cardiovascular diseases causing approximately 75 000 death per year in Canada only. Apolipoprotein B (ApoB) is an essential structural component of low density lipoproteins (LDL), which are responsible for the initiation and the development of atherosclerosis. Actual medication can only slow the atherosclerotic development instead of targeting the source of the problem which is the ApoB. Hence the importance of finding a new biomedical technique such as the ApoB gene silencing using a system designed to release small interfering RNAs (siRNA) in targeted cells. We therefore hypothesized that intravenous administration of chitosan/siRNA-ApoB nanoparticles would be able to induce safe therapeutic effects in a murine model of atherosclerosis. Chitosan is a cationic, natural and biodegradable polymer whose intrinsic characteristics vary according to its degree of deacetylation (DDA), molecular weight (MW) and the chitosan's amine : siRNA's phosphate ratio (N:P) used to form nanoparticles. Chitosan formulations (DDA-MW-N:P) used in this research project, either 92-10-5, 80-80-5 and 80-10-10, were previously studied in gene therapy. Analysis using Environmental Scanning Electron Microscopy and Dynamic Light Scattering (DLS) showed that spherical and homogenous chitosan/double stranded oligonucleotides (dsODN)-ApoB nanoparticles had sizes and zeta (δ)-potentials ranging respectively from 41 to 108 nm and 15 to 23 mV. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) demonstrated the high stability of chitosan/dsODN-ApoB nanoparticles formed with chitosan 92-10 at various N:P ratios when incubated in solution of various pHs for various amounts of time. We also demonstrated using agarose gel electrophoresis that chitosan efficiently protected dsODN-ApoB from digestion by supraphysiological concentrations of desoxyribonuclease I (DNAse I) (2 units of DNAse I/μg of dsODN). We determined using flow cytometry that chitosan (92-10-5)/dsODN-ApoB nanoparticles attained transfection levels of 55, 86 and 66 % in HepG2, HEK293 and RAW264.7 cells respectively. In the same cell lines, confocal microscopy imaging showed internalized nanoparticles, as well as released dsODN-ApoB indicative of endolysosomal release.