Optimisation et étude de vieillissement des nanoparticules d'or fonctionnalisées pour la détection du cancer du sein

La fonctionnalisation des nanoparticules d’or (AuNPs) est une étape déterminante pour leur utilisation en diagnostic biomédical, notamment pour le ciblage de récepteurs surexprimés par les cellules cancéreuses, comme HER2. Ce mémoire décrit le développement et la validation d’une stratégie de fonctionnalisation robuste et reproductible pour les AuNPs, en réponse aux limitations d’une approche initiale par PEGylation qui s’est avérée peu fiable et reproductible lors de changements de lots de nanoparticules. Une nouvelle méthode basée sur le greffage de calixarènes a été investiguée et optimisée. Cette approche a permis d’obtenir des AuNPs fonctionnalisées de manière stable et homo-gène, comme l’ont confirmé les mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et les tests par Lateral Flow Assay (LFA). L’étude comparative de différents fournisseurs de na-noparticules a mené à la sélection de la compagnie NanoBrand pour ses caractéristiques optimales. L’importance cruciale de la pureté des anticorps a également été démontrée, la filtration du Trastuzumab étant indispensable à une bioconjugaison efficace. Un protocole ELISA quantitatif, utilisant des plaques préparées manuellement, a été développé avec suc-cès pour caractériser la liaison des AuNPs fonctionnalisées à la protéine HER2. Une étude de stabilité complète sur six semaines a ensuite été menée pour évaluer la conserva-tion des propriétés physico-chimiques et de la fonctionnalité biologique des AuNPs greffées au calixarène et bioconjuguées avec des anticorps anti-HER2. Différentes concentrations de ca-lixarène et cinq tampons de conservation ont été testés. Les résultats ont montré une bonne stabilité colloïdale (Diffusion Dynamique de la Lumière) et chimique (spectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier, UV-Vis) des AuNPs, ainsi qu’une persistance de la liaison des anticorps (Dosage à Flux Latéral) sur la durée de l’étude. Une concentration standard à 5,67 mg/mL (1X) de calixarène s’est avérée préférable à des concentrations plus élevées pour la stabilité à long terme. Cependant, bien que la reconnaissance spécifique des cellules HER2-positives (SK-BR3) ait été initialement observée, une perte progressive de sélectivité et une augmentation de l’attachement non spécifique aux cellules HER2-négatives (MDA-MB-231) ont été constatées au fil du temps. Parmi les tampons testés, le Buffer 2 (contenant du ProClin 300) et le Buffer 4 (contenant de l’azide de sodium) ont semblé offrir une meilleure préservation de la spécificité cellulaire.

Abstract

Functionalizing gold nanoparticles (AuNPs) is a decisive step for their use in biomedical di-agnostics, particularly for targeting receptors that are over-expressed by cancer cells such as HER2. This thesis describes the development and validation of a robust, reproducible strat-egy for AuNP functionalization, devised to overcome the limitations of an initial PEGylation approach that proved unreliable with new nanoparticle batches. A new calixarene-grafting method was investigated and optimized. This approach produced stably and homogeneously functionalized AuNPs, as confirmed by dynamic light scattering (DLS) measurements and Lateral Flow Assay (LFA) tests. Comparative evaluation of differ-ent nanoparticle suppliers led to the selection of the compagny NanoBrand for its optimal characteristics. The critical importance of antibody purity was also demonstrated: filtering trastuzumab was essential for efficient bioconjugation. In addition, a quantitative ELISA protocol using manually coated plates was successfully developed to characterize the binding of the functionalized AuNPs to HER2 protein. A comprehensive six-week stability study was then carried out to evaluate the preservation of the physicochemical properties and biological functionality of calixarene-coated, anti-HER2-conjugated AuNPs. Various calixarene concentrations and five storage buffers were tested. The results showed good colloidal stability (DLS) and chemical stability (FTIR, UV–Vis) of the nanoparticles, as well as sustained antibody binding (LFA) throughout the study. A standard calixarene concentration at 5,67 mg/mL (1×) proved preferable to higher con-centrations for long-term stability. Nonetheless, while specific recognition of HER2-positive SK-BR-3 cells was initially observed, a gradual loss of selectivity and increased nonspecific attachment to HER2-negative MDA-MB-231 cells appeared over time. Among the buffers tested, Buffer 2 (containing ProClin 300) and Buffer 4 (containing sodium azide) seemed to better preserve cellular specificity.