Development of Fed-Batch and Perfusion Strategies for Intensified Influenza Virus Production in Cell Culture Processes

Cell culture processes are increasingly identified as a more flexible, scalable, and responsive alternative to traditional egg-based systems for the production of influenza virus vaccines. In order to become a cost-effective platform, cell culture-based virus production processes must be intensified, which up to now has been achieved almost exclusively through the development of perfusion operations. While perfusion processes typically support higher cell densities resulting in higher productivities, the large volumes of medium consumed raise challenges for medium preparation and handling, notably in large scale operations. In this scenario, the main goal of this doctorate research was to develop efficient feeding strategies to intensify influenza virus production in cell culture processes aiming to minimize medium consumption. To accomplish that, fed-batch, perfusion and hybrid feeding strategies were developed based on a streamlined approach for assessing the general metabolism of the cells based on key nutrients. In the first part of this work, we developed processes to intensify the production of influenza virus in high cell density cultures of HEK293 cells. While using a shake tube scale-down model, we have designed a hybrid fed-batch/perfusion and a perfusion operation based on two different feeding strategies: i) a dynamic fed-batch strategy, in which addition of concentrated feed was performed based on the cell growth and the main metabolic profile of cells; ii) a perfusion strategy, in which the perfusion medium was supplemented with a concentrated feed to reduce the required perfusion rate (PR). The established processes were then scaled up to a benchtop bioreactor coupled to a Tangential Flow Depth Filtration (TFDF) membrane module as cell retention device. Successful influenza virus production was reported for cultures infected in the range of 8–10 × 106 cells/mL, resulting, for bioreactor runs, in more than 4-fold increase in total production and 3-fold increase in space time yield (STY) when compared to a low cell density batch reference. We have thus demonstrated that feeding strategies that limit medium consumption are suitable for large-scale influenza virus manufacturing.

Résumé

Les procédés de culture cellulaire sont de plus en plus considérés comme une alternative plus flexible, plus évolutive et plus réactive que les systèmes traditionnels à base d'œufs pour la production de vaccins contre le virus influenza. Pour devenir une plateforme rentable, les processus de production de virus à partir de cultures cellulaires doivent être intensifiés, ce qui, jusqu'à présent, a été réalisé presque exclusivement par le développement d'opérations en mode perfusion. Si les procédés en mode perfusion permettent généralement d'obtenir des densités cellulaires plus élevées, et donc une meilleure productivité, les volumes importants de milieu de culture consommés entrainent des défis au niveau de la préparation et de la gestion des courants d’entrée et de sortie, notamment dans les opérations à grande échelle. Dans ce contexte, l'objectif principal de cette thèse était de développer des stratégies d'alimentation efficaces pour intensifier la production de virus influenza dans des processus de culture cellulaire visant à minimiser la consommation de milieu de culture. Pour ce faire, des stratégies d'alimentation en modes fed-batch, perfusion et hybride ont été développées sur la base d'une approche simplifiée permettant d'évaluer le métabolisme général des cellules en fonction de la consommation des principaux nutriments. Dans la première partie de ce travail, nous avons développé des procédés pour intensifier la production de virus influenza dans des cultures à haute densité de cellules HEK293. En utilisant des spin tubes comme modèle à petite échelle, nous avons conçu un mode d’opération hybride fed-batch/perfusion et un mode perfusion basée sur : i) une stratégie fed-batch dynamique, dans laquelle l'ajout de milieu de culture concentré a été effectué en fonction de la croissance cellulaire et du profil métabolique principal des cellules; ii) une stratégie de perfusion, dans laquelle le milieu de perfusion a été enrichi avec du milieu de culture concentré afin de réduire le taux de perfusion requis. Les processus établis ont ensuite été transposés à un bioréacteur couplé à un module de filtration en profondeur à flux tangentiel (Tangential Flow Depth Filtration, TFDF) comme dispositif de rétention des cellules. Ces stratégies ont permis de produire efficacement dans des cultures infectées entre 8–10 ×106 cellules/mL, résultant en une augmentation de plus de 4 fois de la production totale et de 3 fois du rendement espace-temps (space time yield, STY), par rapport à une culture référence opérée en mode batch et à faible densité cellulaire. Nous avons ainsi démontré que les stratégies d'alimentation qui minimisent la consommation de milieu de culture sont adaptées à la fabrication de virus influenza à grande échelle.