Quantitative and Multiplexed Protein Detection Using Plasmonic Nanoparticles: From Bioconjugation to Hyperspectral Detection

La quantification précise de l’expression des protéines dans les biopsies tissulaires est essentielle pour déterminer l’éligibilité des patients aux thérapies ciblées en oncologie moderne. Les thérapies ciblées offrent des avantages significatifs par rapport à la chimiothérapie traditionnelle en s’attaquant spécifiquement aux mécanismes moléculaires permettant la progression du cancer, améliorant ainsi la santé mais aussi la qualité de vie des patients. Cependant, l’hétérogénéité du cancer pose des défis, car seuls des profils moléculaires spécifiques des tumeurs répondent aux traitements ciblés. Par exemple, dans le cancer du sein, bien que la présence du récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2 (Her2) soit cor-rélée à la réponse au Trastuzumab, seules les tumeurs présentant une forte expression de Her2 répondent au traitement. L’évaluation clinique actuelle de l’expression de Her2 par immunohistochimie est semi-quantitative, nécessitant des tests supplémentaires pour les cas équivoques et ne parvenant pas à identifier les patients avec une faible expression de Her2 qui pourraient bénéficier de nouvelles thérapies. De plus, le manque de multiplexage dans la détection de protéines représente une autre piste d’amélioration pour les tests. En effet, dans certains cas, la capacité à détecter plusieurs types de protéines dans une même biopsie permet d’augmenter la fiabilité du diagnostic quant à l’éligibilité des patients aux thérapies ciblée. C’est notamment le cas pour le Pembrolizumab prescrit à certains patients atteints du cancer du poumon "à cellules non petites" (non-small cells lung cancer). Malgré l’apparition d’alternative intéressantes en recherche, comme l’immunofluorescence ou la spectrométrie de masse, des défis persistent dans l’évaluation précise de l’expression des protéines en clinique. Pour surmonter ces défis, on propose l’utilisation de nanoparticules plasmoniques avec des signatures spectrales distinctes comme amplificateurs de signal, permettant un diagnostic multiplexé et quantitatif par comptage individuel des nanoparticules, selon un protocole dit "marquage immunoplasmonic". Cette thèse vise à établir une méthodologie robuste utilisant un panel de nanoparticules plasmoniques soigneusement sélectionnées pour une quantification précise des protéines et une détection multiplexée dans des échantillons biologiques. On démontre l’utilisation de NPs en alliage or-argent, de NPs d’or sphériques et de nanorods d’or pour une visualisation optimale. On montre également que la méthode proposée s’intègre parfaitement dans les routines de travail de la pathologie clinique, en pouvant s’effectuer sur des échantillons de biopsie typiques et permettant une visualisation directe du marquage par les pathologistes. Les principaux objectifs incluent le couplage nanoparticule-anticorps, le raffinement de la détection optique des nano-rapporteurs et l’intégration des techniques proposées dans des environnements cliniques.

Abstract

Accurate quantification of protein expression in tissue biopsies is vital for determining patient eligibility for targeted therapies in modern oncology. Targeted therapies offer signifi-cant advantages over traditional chemotherapy by specifically addressing cancer progression molecular pathways, thus improving patient outcomes. However, the heterogeneity of cancer poses challenges, as only specific tumour molecular profiles respond to targeted treatments. For instance, in breast cancer, the presence of human epidermal growth factor receptor 2 (Her2) correlates with responsiveness to Trastuzumab, but only tumours with high Her2 expression benefit from this therapy. Current clinical evaluation of Her2 expression using immunohistochemistry (IHC) is semi-quantitative, necessitating additional tests for equivo-cal cases and failing to identify patients with low Her2 expression who could benefit from novel therapies. Multiplexed detection of biomarkers presents another critical area for improvement, as it would significantly strengthen the determination of patient eligibility for therapies like Pembrolizumab in non-small-cell lung cancer. Despite the emergence of interesting alternatives in research, such as immunofluorescence or mass spectrometry, challenges persist in accurately evaluating protein expression in clinical settings. To overcome these challenges, plasmonic nanoparticles (NPs) with distinctive spectral signatures are proposed as signal enhancers, allowing quantitative multiplexed diagnosis through individual NP count-ing, through a methodology that we call "immunoplasmonic labelling". This thesis aims to establish a robust methodology using a panel of carefully selected plasmonic nanoparticles for precise protein quantification and multiplexed detection in biological samples. We have demonstrated the utilization of gold-silver alloy NPs, spherical gold NPs, and gold nanorods for optimal visualization. Moreover, the proposed methodology can be integrated seamlessly into clinical pathology workflows, accommodating typical biopsy samples and visible-range NPs for pathologists to visualize the staining directly. Key objectives include nanoparticle-antibody coupling, refining optical detection of nano-reporters, and integrating proposed techniques into clinical settings. The various Chapters will cover essential concepts about the optical properties of plasmonic nanoparticles and advanced imaging techniques, nanoparticle surface engineering and protein detection using NPs. Our investigations include two differ-ent grafting techniques to obtain nanoparticle-antibodies conjugates based on polyethylene glycol or calixarene cross-linkers. We also achieved a demonstration of the quantitative and multiplexed detection of proteins in various samples, including tissue biopsies.