Échafaudage cellulaire en nanofibres de polymère et verre bioactif pour la guérison des plaies diabétiques

Une partie des patients diabétiques souffrent de plaies chroniques sur les membres inférieures appelées ulcères diabétiques. Ces plaies sont à l’origine de pertes de qualité de vie et d’argent importantes pour le système de santé et les patients. La longue durée d’ouverture de ces plaies les ouvre à des infections bactériennes, nécessitant parfois des amputations. Cette chronicité est expliquée d’une part par la faible quantité de facteurs de croissance dans ces plaies, et d’autre part par la surproduction de molécules à fort effet collatéral par le système immunitaire. Durant les dernières années, les intérêts de recherche se sont centrés sur la production d’échafaudages cellulaires bioactifs, qui remplacent les tissus abîmés et motivent la croissance de nouveaux tissus pour permettre de fermer la plaie. Depuis un peu plus d’une vingtaine d’années, l’électrofilage a démontré être une technique permettant de fabriquer des fibres nanométriques avec une grande variété de structures et de compositions disponibles. Cette technique a donc attiré l’attention pour la production d’échafaudages cellulaire, notamment dans le cadre des plaies diabétiques. La production de fibres imitant la matrice extracellulaire, biodégradables et bioactives, en est la raison. Le but de ce projet de maîtrise était de développer un échafaudage cellulaire électrofilé et bioactif dans le cadre d’une plaie diabétique. Dans un premier temps, un premier matériau composé de fibres d’alcool polyvinylique (PVA) et d’alginate a été produit, mais après avoir rencontré de trop nombreux obstacles, notam-ment la solubilité trop importante, la difficulté de manipulation et la faible quantité de matériau produite, ce matériau a été écarté. Ce matériau devait être la couche supérieure d’une structure bicouche, contenant aussi du chitosane, du verre bioactif, et du plasma riche en plaquettes lyophilisé. Dans un second temps, un matériau composé de fibres d’acide polylactique (PLA) et de nano-particules de verre bioactif (nBG), un matériau proangiogénique, antibactérien et promouvant la prolifération cellulaire, a été produit par électrofilage. Une analyse par microscopie élec-tronique a permis de déterminer la taille des fibres et leur morphologie. Un test de traction jusqu’à la rupture a permis de déterminer l’effet de l’incorporation des nanoparticules sur les caractéristiques mécaniques des fibres. Ensuite, des essais in vitro ont été réalisés afin de déterminer l’effet de l’échafaudage sur la prolifération et la viabilité de cellules L929. Ces tests ont été menés à l’aide des colorants PrestoBlue HS(invitrogen) et du LIVE/DEAD Cell Imaging Kit(Invitrogen) après 1,3 et 7 jours de culture. Par la suite, des cultures de cellule ont été menées sur les matériaux et leur milieu de culture prélevés et envoyés à Eve Technologies pour mesurer les concentrations de facteurs proangiogéniques dans ces derniers. Finalement, un test antibactérien a permis de déterminer si les nanoparticules avaient un effet antibac-térien sur des bactéries Gram-négatif. Dans ces expériences, les fibres de PLA-nBG étaient comparées à des fibres de PLA pures. Il n’a pas été possible de produire des fibres de PLA contenant plus de 5% de nanoparticules de verre à cause de la dégradation hydrolytique catalysée par les nBG dans la solution d’élec-trofilage. Une analyse thermogravimétrique a confirmé que les fibres produites contenaient près de 90% de la masse de nanoparticules ajoutées. Les fibres de PLA-nBG ont un diamètre entre 100 et 250 nm contre entre 0,6 et 1,1 µm pour les fibres de PLA. La présence des na-noparticules n’a pas affecté la rigidité du matériau et a diminué la contrainte et l’élongation à la rupture à 0,9 MPa contre 1,3 MPa et 10% contre 65% respectivement pour les fibres de PLA-nBG et de PLA. La prolifération de cellules L929 après 7 jours était améliorée sur le PLA-nBG comparé au PLA de presque 30%. La viabilité des cellules était aussi améliorée avec un étalement plus important des cellules et une toxicité réduite en présence de nano-particules, particulièrement notables après 7 jours. La production de certains facteurs proan-giogéniques, notamment l’endogline et les facteurs de croissance placentaires (PLGF) a été améliorée, mais la production de facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) est restée semblable pour les deux matériaux. Aucun effet antibactérien n’a été constaté pour le PLA-nBG après 24 h de culture bactérienne sur ce dernier. Le matériau présente un intérêt pour la guérison des plaies diabétiques en promouvant la pro-lifération et la viabilité des cellules ensemencées à sa surface. Le matériau démontre aussi des effets proangiogéniques, même s’ils sont limités. De nouvelles recherches sont nécessaires pour que ce matériau atteigne son plein potentiel. Un solvant différent pour la solution d’électro-filage limiterait la dégradation hydrolytique du PLA en présence de nBG et augmenterait la taille des fibres et des pores du matériau. Des nBG de plus petit diamètre permettraient une meilleure incorporation dans les fibres de PLA et une plus grande réactivité à leur surface. Finalement, des nBG basés sur du borate, contre du silicate dans le cas de cette recherche, pourraient aussi augmenter cette réactivité.

Abstract

A portion of diabetic patients suffer from chronic sores on the lower limbs called diabetic foot ulcers. These wounds are the cause of significant losses in quality of life and money for the health system and patients. The long duration of the opening of these wounds opens them up to bacterial infections, sometimes requiring amputations. This chronicity is explained on the one hand by the low quantity of growth factors in these wounds, and on the other hand by the overproduction of molecules with a strong collateral effect by the immune system. In recent years, research interests have centered on the production of bioactive cellular scaffolds, which replace damaged tissue and motivate the growth of new tissue to help close the wound. For a little over twenty years, electrospinning has proven to be a technique for manufacturing nanoscale fibers with a wide variety of structures and compositions available. This technique has therefore attracted attention for the production of cellular scaffolds, also in the context of diabetic wounds. The production of fibers that mimic the extracellular matrix, are biodegradable and bioactive, is the reason for this interest. The aim of this master’s project was to develop an electrospun and bioactive cellular scaffold in the context of a diabetic wound. Initially, a first material composed of PVA and alginate fibers was produced, but after en-countering too many obstacles, including excessive solubility, difficulty in handling and the low quantity of material produced, this material was discarded. This material was to be the top layer of a bilayer structure, also containing chitosan, bioactive glass, and freeze-dried platelet-rich plasma. Secondly, a material composed of fibers of PLA and nBG, a proangiogenic, antibacterial and cell proliferating material, was produced by electrospinning. An analysis by electronic mi-croscopy made it possible to determine the size of the fibers and their morphology. A tensile test until rupture made it possible to determine the effect of the incorporation of nanopar-ticles on the mechanical characteristics of the fibers. Then, in vitro tests were performed to determine the effect of the scaffold on the proliferation and viability of L929 cells. These tests were carried out using PrestoBlue HS (invitrogen) and the LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (Invitrogen) after 1,3 and 7 days of culture. Subsequently, cell cultures were carried out on the materials and their culture medium collected and sent to Eve Technologies to measure the concentrations of proangiogenic factors in them. Finally, an antibacterial test made it possible to determine whether the nanoparticles had an antibacterial effect on Gram-negative bacteria. In these experiments, PLA-nBG fibers were compared to pure PLA fibers. It was not possible to produce PLA fibers containing more than 5% glass nanoparticles due to nBG-catalyzed hydrolytic degradation of PLA in the electrospinning solution. A thermogravimetric analysis confirmed that the fibers produced contained almost 90% of the mass of nanoparticles added. PLA-nBG fibers have a diameter between 100 and 250 nm against between 0,6 and 1,1 µm for PLA fibers. The presence of nanoparticles did not affect the stiffness of the material and reduced the ultimate tensile strength to 0.9 MPa against 1.3 MPa for PLA fibers. Proliferation of L929 cells after 7 days was improved on PLA-nBG compared to PLA by almost 30%. Cell viability was also improved with greater cell spreading and reduced toxicity in the presence of nanoparticles, particularly notable after 7 days. The production of certain proangiogenic factors, in particular endoglin and PLGF was improved, but the production of VEGF remained similar for the two materials. No antibacterial effect was observed for PLA-nBG after 24 h of bacterial culture on the material. The material has potential for the healing of diabetic wounds by promoting the proliferation and viability of cells seeded on its surface. The material also demonstrates proangiogenic effects, albeit limited. Further research and improvements are needed for this material to reach its full potential. A different solvent for the electrospinning solution would limit the hydrolytic degradation of PLA in the presence of nBG and increase the fiber and pore size of the material. Finer nBG would allow better incorporation into PLA fibers and greater reactivity on their surface. Finally, nBGs based on borate, against silicate in the case of the material experimented on in this study, would further enhance reactivity.