Biofunctionalization of Gold Nanoparticles with Antibodies to Design an Enhanced Immunological Diagnostic Tool for Cancer

Le cancer du sein est à la fois la forme de cancer la plus diagnostiquée et la deuxième cause de mortalité chez les femmes canadiennes. L'immunohistochimie (IHC) est une technique étalon pour la caractérisation en profondeur des tissus et le diagnostic précis de la tumeur du cancer du sein. Cette technique repose sur l'étude immunologique des tissus, par le biais d'anticorps chromogènes générant un signal colorimétrique. Toutefois, cette technique a plusieurs inconvénients, notamment la perte ou la modification d'antigènes ciblés pendant la préparation du tissu ou encore le risque de photoblanchiment. De plus, l'analyse des résultats peut varier grandement selon le pathologiste responsable de l'examen du tissu. Ces éléments peuvent avoir un impact négatif sur la sensibilité et la spécificité du diagnostic, et ainsi augmenter la probabilité de faux positifs et faux négatifs. Ainsi, augmenter la précision des tests de diagnostic du cancer du sein demeure un enjeu important pour une meilleure prise en charge des patients diagnostiqués. Ce mémoire présente l'utilisation de nanoparticules d'or (AuNPs) immunoplasmoniques comme une alternative à l'IHC pour le diagnostic du cancer du sein. Des anticorps ciblant des biomarqueurs du cancer du sein sont chimiquement conjugués aux AuNPs par l'intermédiaire de polyéthylène glycol (PEG) portant en bout de chaîne des groupes fonctionnels réactifs. Dans ce mémoire, d'importantes contributions portant sur le développement d'AuNPs fonctionnalisées sont, dans un premier temps, passées en revue, afin de mettre en lumière les enjeux chimiques et physiques qui entourent la conception de formulations stables, robustes, fiables, reproductibles et sensibles capables de cibler et de se lier à des cellules cancéreuses de façon spécifique. Les travaux expérimentaux présentés dans la suite du mémoire ont pour objectif principal la comparaison de trois différentes stratégies de fonctionnalisation covalente des AuNPs avec des anticorps. Ces stratégies portent sur l'orientation des anticorps greffés par rapport à la surface des AuNPs. Pour chacune, les avantages et inconvénients relatifs à la préparation, l'optimisation, et le comportement des AuNPs lorsque mises en présence de cellules cancéreuses sont évalués. Les propriétés chimiques et physiques, ainsi que les rendements et l'activité biologique sont caractérisés. Enfin, sur la base des résultats expérimentaux rapportés, une comparaison critique des trois stratégies de fonctionnalisation est proposée. Les bénéfices de la conjugaison covalente des anticorps sur les AuNPs, par rapport à leur simple adsorption physique, sont également discutés. Les travaux présentés dans ce mémoire permettent de mettre en évidence des différences à la fois au niveau des propriétés chimiques, optiques, des rendements et de l'activité lors de la comparaison de deux stratégies de conjugaison covalentes. Des conditions pour un meilleur contrôle de la stabilité, fiabilité et reproductibilité des formulations ont été identifiées. De plus, des différences sont observées dans la capacité des AuNPs à se lier à deux lignées cellulaires cancéreuses, MDA-MB-231 et MDA-MB-453. Ce mémoire constitue une contribution importante pour le domaine de recherche portant sur la biofonctionnalisation d'AuNPs à des fins diagnostiques, en apportant une caractérisation approfondie de chaque étape de différents protocoles de fonctionnalisation. Des travaux futurs, portant notamment sur la caractérisation de l'activité biologique des anticorps greffés aux AuNPs ainsi que sur l'applications des AuNPs immunoplasmoniques à des systèmes biologiques plus complexes, restent nécessaires. Néanmoins, les travaux présentés dans ce mémoire ont produit des résultats prometteurs permettant d'ouvrir la voie vers la conception d'AuNPs immunoplasmoniques à des fins diagnostiques, avec pour objectif à long terme le développement de techniques diagnostiques alternatives à l'IHC pour le diagnostic du cancer du sein.

Abstract

Breast cancer is the most diagnosed form of cancer in Canadian women, and is the second leading cause of death for them. In a histological setting where breast cancer tissue is examined, immunohistochemistry (IHC) is the go-to technique for providing a more in-depth diagnosis of the breast cancer tumour. The technique relies upon immunological-based staining of the tissue and generation of a colorimetric signal from chromogenic antibodies. However, this technique suffers from several drawbacks, namely loss or modifications of targeted antigens during preparation of the tissue, variations in skill of the examining pathologist, and photobleaching. These can all reduce both the sensitivity and specificity of the diagnosis and increase the likelihood of a misdiagnosis or a failure to detect it. Improving the accuracy of cancer diagnostics is thus an important issue to address, so as to more appropriately proceed to care management of the diagnosed patient. In this thesis work, functionalized immunoplasmonic gold nanoparticles (AuNPs) are a proposed alternative to IHC for breast cancer diagnosis. Herein, breast cancer-detecting antibodies are chemically conjugated to AuNPs via polyethylene glycol (PEG) linkers containing reactive functional groups located at the ends of their chains. This thesis work will review important contributions discovered in developing these functionalized AuNPs, by elucidating the chemical and physical challenges related to designing stable, robust, reliable, reproducible, and sensitive formulations that can specifically target and bind to cancer cells. The main goals of this thesis work were to compare and contrast different strategies for functionalizing AuNPs with antibodies on the basis of their advantages and disadvantages in preparation, optimization and their ultimate application to cancer cells. Each part of this thesis will review in turn three different strategies that would orient antibodies with respect to AuNPs in different ways, such that both the chemical and physical properties, yield and biological activity could all be characterized. This allowed for a final head-to-head comparison between all three chemical conjugation strategies, alongside a comparison to antibodies physically adsorbed to AuNPs in a non-specific manner. Overall, differences in chemical and physical properties, yield and activity were all observed for two different chemical conjugation strategies, and various parameters influencing their stability, reliability and reproducibility were optimized. In addition, differences were seen regarding their abilities to bind to two different cancer cell lines, MDA-MB-231 and MDA-MB-453. This thesis work thus constitutes an important contribution to the research field of AuNP functionalization for diagnostic purposes, by providing a more in-depth characterization of each step of the process of functionalization. It also provides insight on how various parameters could be controlled and ultimately influence the ability of each strategy to produce functionalized AuNPs capable of recognizing and binding to cancer cells. Although further work still needs to be pursued in order to better characterize the biological activity of the antibodies bound to these functionalized AuNPs, as well as applying these formulations to more complex biological systems, this work has produced promising results that should hopefully shed light on designing improved immunoplasmonic AuNPs for diagnostic purposes. This could lead to breakthroughs in the field that would ultimately produce an alternative technique to rival IHC in cancer diagnostics.