Fonctionnalisation de nanoparticules plasmoniques pour le ciblage de cellules du cancer du sein in vitro

Le cancer du sein représente un quart des cas de cancer diagnostiqués chez les femmes au Canada. De nos jours, le moyen le plus efficace de diagnostiquer le cancer du sein consiste à effectuer une biopsie de la zone suspecte chez le patient et à l'analyser en laboratoire. L'étalon d'or utilisé par les pathologistes pour déterminer si les tissus sont cancéreux ou non est la coloration par immunohistochimie (IHC). Cette méthode présente plusieurs inconvénients, tels que la dégradation possible des antigènes ciblés en raison de l'utilisation d'agents de fixation (Formaline, etc.) ou la difficulté à cibler plusieurs antigènes dans un même échantillon. Dans ce projet sera présenté un moyen de répondre à ces problèmes en utilisant des nanoparticules (NP) plasmoniques fonctionnalisées avec des anticorps (Ac) pour cibler spécifiquement des cellules du cancer du sein. Outre une grande stabilité qui permet d'éviter l'utilisation d'agents de fixation avant le marquage des cellules, les NPs biocompatibles ont des propriétés optiques particulières qui permettent de les visualiser et de les compter facilement. L'objectif final est de développer et appliquer un protocole robuste qui pourra être appliqué directement par les pathologistes au Canada et montrera des résultats capables de rivaliser avec l'IHC. La première partie du mémoire concerne la fonctionnalisation des NPs et leur caractérisation. Trois approches de fonctionnalisation ont été testées : EDC/(Sulfo-)NHS (N-3- (dimethylamino)propyl-N-ethylcarbodimide hydrochloride/ N - Hydroxy(sulfo)succinimide), NHS et Hydrazide. Ces noms font référence au groupe fonctionnel qui se lie à l'Ac. Dans le cas des approches utilisant des esters NHS, la liaison se fait aux amines primaires des Ac qui sont réparties dans toute leur structure. On parle donc de fonctionnalisation non orientée car la position du site de liaison sur les Ac est aléatoire et les domaines Fab peuvent ainsi être liées aux NPs. C'est pourquoi le protocole Hydrazide, spécifique au domaine Fc des Ac, présentait un intérêt particulier. Les trois procédures ont été adaptées pour des NPs d'or (AuNPs) sphérique de 100 nm de diamètre et celles-ci ont été caractérisées par des mesures des spectres d'absorbance, de la taille hydrodynamique, du potentiel zêta ainsi que des techniques d'imageries et de dosage à l'aide d'Ac conjugués à des fluorophores. Tous ces résultats ont mené à la conclusion que le protocole EDC/NHS effectué à pH 7 était le plus robuste et assurait la plus grande couverture en Ac sur les NPs. Une fois la fonctionnalisation maîtrisée, la seconde partie de ce mémoire présentera comment utiliser ces NPs pour évaluer quantitativement l'expression de certains antigènes (CD44, HER2 et CD24) sur trois lignées cellulaires de cancer du sein (MDA-MB-231, MDA-MB-453 et BT-474). La méthode développée dans ce projet de maîtrise présente la nouveauté d'incuber les cellules en suspension et non plus en pétri comme dans les modèles de marquage bidimensionnels classiques. Les résultats de l'immunomarquage avec les AuNPs (immunoplasmonique) sont directement comparés aux résultats d'immunofluorescence pour la quantification des antigènes. Une bonne corrélation a été trouvée entre les deux tests pour les MDA-MB-231 (tous antigènes confondus) et pour les MDA-MB-453 (excepté pour le CD24). Les BT-474 ont démontré des résultats incohérents avec l'immunofluorescence avec un faible nombre de nanoparticules par cellules pour tous les antigènes. Les expériences d'immunoplasmoniques ont également été réalisées en présence de sérum humain et les mêmes tendances ont été observées. Au vu de ces résultats, il est recommandé pour de futures études de se pencher sur l'optimisation des techniques de purification des AuNPs fonctionnalisées ainsi que sur le développement d'un contrôle qualité pour mesurer l'activité des anticorps. Aussi, en vue d'une standardisation des procédés, il faudrait augmenter le nombre de AuNPs par cellules pour réduire la variabilité de la mesure.