Pulsed Laser Manipulation of Cells Decorated by Plasmonic Nanoparticles

Au cours des dernières décennies, la thérapie cellulaire a suscité un intérêt considérable dans les domaines de la recherche biomédicale et théranostique. Une large gamme d'applications biomédicales a obtenu des avantages fructueux par une manipulation directe de cellules (cellules seuls ou groupes de cellules individuelles) en contrôlant la concentration de nanoparticules plasmoniques fonctionnelles et de lasers à impulsions. Cependant, tous ces protocoles de transfection, accompagnés d'une efficacité et d'une toxicité de transfection cellulaire variées, sont applicables pour une condition spécifique. Ainsi, l'optoporation doit être explorée, optimisée et généralisée pour un large éventail de thérapies cellulaires délicates et complexes par le laser. Un suivi en temps réel des cellules optoporées révèle les mécanismes impliqués dans une transfection réussie sans induire de cytotoxicité. Dans cette thèse, le laser pulsé nanoseconde (532 nm) utilisé pour optoporer une seule cellule cancéreuse humaine du sein (MDA-MB-231) montre clairement les effets des fluences du laser pulsé. L'optoporation intériorise les molécules exogènes (Iodure de Propidium) dans l'intervalle fonctionnel compris entre 0.3 et 0.7 J/cm2 sans provoquer d'effet secondaire (confirmé par Calcein AcetoxyMethyl). La position du faisceau détermine clairement dans quels compartiments subcellulaires les molécules exogènes à intérioriser avec précision. Le faisceau laser focalisé près du noyau dirige intensément l'Iodure de Propidium (PI) pour qu'il réagisse avec les nucléotides cellulaires, alors que pour le faisceau focalisé loin du noyau, le PI se déverse à peine dans le site d'action. Ce protocole d'optoporation, indiquant le rôle critique des nanoparticules plasmoniques liées, nécessite un faisceau laser dirigé vers la position de la nanoparticule plasmonique sur la membrane cellulaire. L'éclairage latéral par LED développé ici visualise simplement la nanoparticule plasmonique liée sur la membrane cellulaire dans une grande zone. Par la suite, un laser femtoseconde dans le proche infrarouge (800 nm) est également utilisé pour optoporer des cellules de lymphocyte T humaines supersensibles (Jurkat) avec un taux de survie négligeable après une exposition de courte durée à une fluence relativement élevée (252 mJ/cm2). En explorant plusieurs fluences laser et durées d'irradiation, nous obtenons donc une gamme applicable de fluences laser (63 à 71 mJ/cm2) et de temps d'irradiation (10 ms) pour l'optoporation de cellules de Jurkat liées à des nanoparticules plasmoniques sans réduire leur viabilité cellulaire. Ces résultats fondamentaux indiquent comment effectuer une optoporation réussie en ajustant les paramètres du laser (fluence, durée d'irradiation, position, etc.) sur différentes lignées cellulaires afin d'atteindre une haute transfection pour une large gamme d'applications biomédicales.

Abstract

In the last decades, cell therapy has attracted tremendous interests in biomedical and theranostic research fields. A wide range of biomedical applications has gained fruitful benefits by a direct manipulation of cells (whether single cell or bunch of individual cells) by controlling the concentration of functional plasmonic nanoparticles and pulsed lasers. However, all these transfection protocols, accompanied by a varied cellular transfection efficiency and toxicity, are applicable for a specific condition. Thus, the optoporation needs to be explored, optimized, and generalized for a broad range of delicate and complex laser mediated cell therapies. A real-time monitoring of the optoporated cells reveals mechanisms involved in a successful transfection without inducing cytotoxicity. In this thesis, the nanosecond pulsed laser (532 nm) used to optoporate a single adherent human breast cancer cell (MDA-MB-231) clearly shows effects of the pulsed laser fluences. The optoporation internalizes the exogenous molecules (Propidium Iodide) at the functional range between 0.3 to 0.7 J/cm2 without causing a side effect (confirmed by Calcein AcetoxyMethyl). The beam pointing location clearly determines in which subcellular compartments the exogenous molecules to be internalized precisely. The laser beam localized close to the nucleus intensively directs the Propidium Iodide there to react with cellular nucleotides, whereas the beam far away from the nucleus barely fluxes into the site of action. This optoporation protocol, indicates the critical role of the bound plasmonic nanoparticles, is required a laser beam to be directed to the position of the plasmonic nanoparticle on the cellular membrane. The lateral LED illumination developed here simply visualizes the bound plasmonic nanoparticle on the cell membrane in a large area. Afterward, near-infrared femtosecond laser (800 nm) is also employed to optoporate supersensitive human T lymphocyte cells (Jurkat) with a negligible survival rate after a short time exposure to a relatively high fluence (252 mJ/cm2). Exploring several laser fluences and irradiation durations, we therefore obtain an applicable range of laser fluences (63 to 71 mJ/cm2) and irradiation time (10 ms) for the optoporation of plasmonic nanoparticles bound Jurkat cells without reducing their cell viability. These fundamental results indicate how to perform a successful optoporation by adjusting laser parameters (i.e., fluence, irradiation duration, position, etc.) on different cell lines in order to achieve high transfection for a wide range of biomedical applications.