Freeze-Dried Chitosan Platelet-Rich Plasma Mixtures for Knee Meniscus Repair

Les maladies musculo-squelettiques constituent un problème important dans la pratique orthopédique. Les pathologies méniscales font partie des blessures les plus fréquentes au genou de l'articulation fémorotibiale, ce qui pose un défi unique aux chirurgiens orthopédistes et constitue une source majeure d'invalidité dans le monde. Le ménisque est un tissu complexe fibrocartilagineux qui absorbe les chocs lorsque les forces sont transmises au compartiment articulaire. Le taux et la réussite de guérison sont limités par les caractéristiques des déchirures, l'état chronique ou aigu, le profil du patient et la stabilité des articulations. Les techniques et traitements actuels de guérison ne sont efficaces que pour les lésions des zones vasculaires externes du ménisque, tandis que la guérison des lésions dans les zones avasculaires internes du ménisque demeure difficile, en particulier dans les cas de déchirures complexes ou traumatiques et dégénératives. La méniscectomie arthroscopique est la chirurgie du genou là couramment effectuée. Elle génère souvent une instabilité fonctionnelle à long terme et finit par évoluer vers une arthrose précoce du genou. La guérison du ménisque et les allogreffes constituent un traitement alternatif à la méniscectomie. Le fardeau clinique et financier important de l'arthrose pousse les scientifiques à étudier des stratégies d'augmentation et de régénération pour stimuler la réponse tissulaire du ménisque. Tout le processus de développement du produit, l'innocuité et l'efficacité des implants médicaux doivent être testés sur des modèles animaux précliniques avant l'application en clinique. Déterminer le modèle animal le plus approprié pour étudier les mécanismes et les processus de guérison du ménisque est essentiel. Ainsi, les grands modèles animaux qui reproduisent la fonction biomécanique, l'anatomie et la composition du ménisque humain sont intéressants et pertinents. Les ovins sont l'un des modèles bien établis d'évaluation préclinique des outils de remplacement et de guérison du ménisque. Mon objectif initial était d'effectuer une revue de la littérature portant sur les traitements actuels pour les lésions du ménisque, ainsi que les stratégies d'augmentation les plus courantes pour augmenter le taux de guérison du ménisque telles que la tréphination, l'abrasion synoviale, l'injection de plasma-riche en plaquettes (PRP) et l'enrobage à l'aide de matériaux de matrice extracellulaire. J'ai également discuté pourquoi des implants de chitosane et de composés sanguins autologues seraient en mesure d'améliorer la guérison du ménisque. Cette revue couvrant les algorithmes de traitement des lésions du ménisque m'a guidée vers une meilleure conception de mes recherches expérimentales au cours de mon doctorat. L'utilisation de PRP autologue a été proposée pour des applications cliniques potentielles, en raison de sa simplicité d'isolation et de sa disponibilité. Le chitosane possède des effets thérapeutiques bénéfiques dans le contexte de pathologies orthopédiques. Des essais comparatifs randomisés et contrôlés sont nécessaires dans le domaine de la guérison du ménisque pour améliorer les symptômes chez les patients, la fonction articulaire et la qualité de vie. Il a été démontré que les formulations lyophilisées de chitosane (CS) pouvant être solubilisées dans du PRP améliorent la guérison du cartilage et de la coiffe des rotateurs dans des modèles animaux précliniques. Ces études m'ont motivé et m'ont amené à évaluer les mécanismes d'action et le processus de guérison induits par le chitosane-PRP dans un contexte de guérison des ménisques. Nos études in vivo nous ont permis d'affiner le modèle de mouton afin de se rapprocher de l'état pathologique de la maladie articulaire chez l'homme. Nous avons découvert qu'augmenter la guérison du ménisque en utilisant des implants hybrides chitosan-PRP en combinaison avec des sutures, la tréphination et l'abrasion est bénéfique et sans danger pour les traitements des anomalies méniscales complexes, ce qui pourrait prévenir l'apparition précoce de l'arthrose à long terme. Cependant, des travaux futurs sont nécessaires pour améliorer davantage les propriétés régénératrices, comprendre les mécanismes en jeu et évaluer l'effet des implants à long terme. Nous avons effectué une observation clinique, évalué la rétention des implants, une évaluation microscopique et macroscopique du ménisque, de la membrane synoviale et du cartilage et avons effectué une cartographie électromécanique des surfaces du cartilage articulaire, à 3 semaines, 6 semaines et 3 mois après la chirurgie. Nos hypothèses de départ pour ces études pilotes de faisabilité étaient les suivantes : 1) La réparation du ménisque serait améliorée par l'application de CS-PRP aux lésions, mais pas par l'application de PRP uniquement ; 2) Que la guérison seraient améliorés en utilisant des implants CS-PRP en conjonction avec la technique d'enrobage par rapport aux implants CS-PRP injectés dans le site de la lésion ou en enrobant seulement. Nous avons constaté que le modèle de lésion unilatérale permettait aux animaux de protéger le genou traité contre la mise en charge postopératoire et d'améliorer le taux de réussite de 25 à 50% par rapport au modèle bilatéral. Les brebis boitaient de façon intermittente quelques semaines après le traitement, peu importe lequel. Les implants de chitosane-PRP résidaient en partie dans les lésions et les canaux de tréphination un jour après la chirurgie. Les lésions étaient visibles macroscopiquement au moment de la nécropsie à 1 jour, 3, 6 semaines et 3 mois et les bords des lésions étaient généralement bien apposés. Un tissu de guérison rougeâtre et des signes de néovascularisation étaient visibles dans les genoux traités au chitosane-PRP à 6 semaines et à 3 mois et les hybrides induisaient le recrutement cellulaire de la périphérie vascularisée du ménisque vers les canaux de tréphination. Une intégration partielle et totale entre le tissu de guérison et le tissu méniscal d'origine a été réalisée dans ces genoux traités. De plus, les implants CS-PRP ont été bien tolérés dans l'environnement du genou et aucune preuve d'effet indésirable n'a été observée pendant la période de suivi. L'ajout d'une technique d'enrobage utilisant la matrice de membrane de collagène Chondro-Gide en conjonction avec des implants CS-PRP ou avec du PRP seul n'a pas amélioré la guérison. En résumé, nos données suggèrent que les implants de chitosane-PRP pourraient à eux seuls résoudre efficacement les limitations actuelles de la guérison du ménisque et posséderaient un potentiel plus grand que le PRP seul pour améliorer les résultats de la guérison et restaurer la fonction du ménisque. Notre troisième objectif était d'évaluer 1) La compatibilité des formulations de chitosane lyophilisées avec différents types de systèmes PRP commercialisés, et 2) De définir une gamme de degrés de désacétylation du chitosan (DDA) et le poids moléculaire moyen en nombre (Mn) qui produiraient des formulations lyophilisées avec des caractéristiques de performance satisfaisantes pour applications orthopédiques. Nos hypothèses de départ étaient les suivantes : 1) Les formulations de chitosan devraient être facilement solubles dans les PRPs du commerce, présenter des propriétés visqueuses et coaguler en temps voulu pour produire des caillots de chitosan-PRP hybrides homogènes qui résistent à la rétraction et sont forts mécaniquement, et 2). Bien que les différents systèmes de préparation de PRP produiraient des PRP ayant des propriétés variables, toutes les préparations de PRP seraient compatibles avec cette technologie. Des formulations contenant 1% m/v de CS, 1% m/v de tréhalose (lyoprotecteur), 42,2 mM de CaCl2 (activateur de la coagulation) ont été préparées avec cinq chitosanes différents. Sept préparations différentes de PRP ont été utilisées pour solubiliser les formulations, notamment : 1) Arthrex Angel fixé à 2% d'hématocrite, 2) Arthrex Angel fixé à 7% d'hématocrite, 3) Harvest SmartPrep 2, 4) RegenLab RegenKit-BCT, 5) RegenLab RegenKit- THT, 6) système de double seringue Arthrex ACP, et 7) système ACE EZ-PRP. La performance des formulations de chitosane-PRP ont été évaluées via la solubilité, le pH et l'osmolalité, les propriétés de coagulation avec la thromboélastographie, les propriétés de coagulation avec une méthode Lee-White modifiée, la viscosité, l'expression des liquides, la résistance mécanique du caillot et l'homogénéité du caillot. L'évaluation macroscopique des formulations lyophilisées a montré qu'elles étaient toutes blanches, homogènes et légèrement rétractées des parois de la fiole après la lyophilisation. Les formulations lyophilisées ont facilement pû être solubilisées avec toutes les préparations de PRP. Les formulations de CS-PRP étaient plus visqueuses que leurs contrôles de PRP, ce qui est attrayant pour une une injection in vivo. Dans le test de coagulation statique, tous les contrôles PRP coagulaient, exprimaient du sérum, se rétractaient et perdaient leur masse de manière significative, tandis que les caillots CS-PRP résistaient à la rétraction du caillot induite par les plaquettes. Les résultats histologiques ont révélé que la dispersion de CS était homogène dans les caillots de CS-PRP. Notre quatrième objectif était d'optimiser et de réduire de 3 à 1 ou 2 jours le cycle de lyophilisation (FD) traditionnellement utilisé dans notre laboratoire, et d'évaluer les performances du produit avec du PRP humain et du plasma commercial. Nos hypothèses de départ étaient les suivantes : 1) Le cycle de lyophilisation des formulations CS peut être optimisé pour minimiser le temps de lyophilisation global de 3 à 1-2 jours afin de produire des formulations lyophilisées stables, 2) Les formulations lyophilisées préparés avec le cycle de lyophylisation plus court seraient solubles dans le PRP humain, seraient visqueuses et coaguleraient rapidement pour produire des caillots hybrides homogènes forts mécaniquement. 3) Du plasma citraté commercial peut être utilisé pour évaluer les performances de la formulation. Des formulations contenant 1% m/v de chitosane DDA 82-84% Mn 45-55 kDa avec 1% m/v de tréhalose et 42,2 mM de CaCl2 ont été préparées pour lyophilisation. La même méthodologie que celle décrite ci-dessus a été utilisée pour évaluer la performance des formulstions lyophilisés. Les formulations lyophilisées ont été solubilisés soit dans du PRP humain citraté soit dans du plasma commercial pour évaluer différentes caractéristiques. Les formulations de CS-PRP étaient plus visqueuses que leurs contrôles de PRP et de plasma. La thromboélastographie a révélé que le temps de réaction du caillot était plus court pour les formulations de chitosane-PRP. De plus, les formulations de chitosane-PRP ont résisté à la rétraction du caillot induite par les plaquettes, tandis que les contrôles PRP ont perdu jusqu'à 80% de leur masse d'origine après coagulation. Les résultats histologiques ont montré que le chitosane était dispersé de manière homogène dans les caillots de CS-PRP. En résumé, nos études pilotes de faisabilité chez le mouton ont montré des résultats prometteurs pour la guérison des lésions complexes par injection de chitosan-PRP, qui pourraient potentiellement être utilisé chez l'homme dans l'avenir. Nous avons raffiné le modèle animal et montré que les animaux pouvaient supporter les implants pendant toute la durée de l'étude sans effet délétère sur le compartiment articulaire, ce qui suggère une innocuité. De plus, les formulations lyophilisées de chitosane se sont révélées compatibles avec plusieurs PRP isolés avec des systèmes commerciaux. Enfin, l'optimisation du cycle de lyophilisation de 3 à 1 jour a été réalisée avec succès et les formulations se sont comportées comme prévu lorsqu'elles étaient solubilisées dans du PRP ou du plasma.

Abstract

Musculoskeletal diseases are a significant problem in orthopedic practice. Meniscal pathologies conditions are among the most frequent knee injuries of the femorotibial joint posing a unique set of challenges for orthopedic surgeons and are a leading source of disability worldwide. The meniscus is a fibrocartilage complex tissue that acts as shock absorbent for forces transmitted over the joint compartment. The rate of healing and success of current surgical meniscus repair are limited by the tear properties, chronic or acute state, patient profile, and joint stability. Current repair techniques and treatments are only effective for defects in outer vascular zones of meniscus while healing of the lesion in the inner avascular zones of menisci remains a significant and present challenge, especially in cases of complex or traumatic and degenerative tears. Arthroscopic meniscectomy is the most common knee surgery which often leads to long-term functional instability and eventually progresses to early knee osteoarthritis (OA). Meniscus repair and allografts have been gaining attention as alternatives to meniscectomy. The significant clinical and financial burden of OA drives scientists to investigate augmentation and regenerative strategies for stimulation of menisci tissue response. All the product development process, safety, and efficacy of medical implants need to be tested in preclinical animal models before the application for clinical translation. Determining of the most suitable animal proxy for investigation of mechanisms and process of meniscus healing to the human joint is a necessity. Thereby, large animal models which duplicate human meniscus biomechanical function, anatomy, and composition are more translatable to clinical practice. Ovine is one of the well-established models for preclinical assessment of meniscus replacement and repair tools. My initial objective was to review the literature and discuss the current clinical management guidelines for primary meniscus repair techniques as well as the most current augmentation strategies to enhance the rate of meniscus healing by using trephination, synovial rasping, abrasion, blood clot placement, platelet-rich plasma (PRP) injections, and wrapping with extracellular matrix materials. I also discussed the rationale for using chitosan polymer and autologous blood component implants to improve meniscus repair. Performing such a review covering treatment algorithms of meniscus lesions guided me to better design my experimental research using polymer-autologous blood component implants to improve meniscus repair during my Ph.D. Autologous PRP is widely used as a source of growth factors in different medical fields. Chitosan (CS) has documented beneficial therapeutic effects in context of orthopedics pathologies. Further randomized and controlled comparative trials are necessary in the field of meniscus and cartilage repair for improving symptoms in patients, joint function, and quality of life. Freeze-dried formulations of CS that can be solubilized in PRP have been shown to improve repair of cartilage and rotator cuff in preclinical small and large animal models. This motivated and drove me to assess mechanisms of action and repair process by using of chitosan-PRP in the context of fibrocartilage menisci repair in sheep as a relevant large animal model. Our in vivo studies allowed us to refine the sheep model in order to be relevant to the pathological condition of joint disease found in the humans. We discovered that augmenting meniscus repair by using chitosan-PRP hybrid implants in combination with sutures, trephination, and rasping is beneficial and safe for treatments of complex menisci defects which could have the potential to prevent early onset of OA in the long-term. However, future work is necessary to further enhance regenerative properties, understand the mechanisms involved, and evaluate the effect of the implants in the long-term. We performed clinical observation, assessed implant retention, microscopic and macroscopic evaluation of meniscus, synovium and cartilage and electromechanical mapping of articular cartilage surfaces, at 3 weeks, 6 weeks, and 3 months post-surgery. Our original hypotheses for these feasibility pilot studies were that I. Meniscus repair would be improved by the application of CS-PRP to the tears, but not by application of PRP alone, and II. That repair outcomes would be improved by using CS-PRP implants in conjunction with the wrapping technique over CS-PRP implants injected in the tear site alone or wrapping alone. We found that the unilateral tear model allowed the animals to protect the treated knee from weight-bearing post-operative and improved success rate from 25 to 50% compared to the bilateral model. The sheep had some intermittent lameness for the a few weeks post- treatment which was not specific to any treatment. The chitosan-PRP implants were partly resident in the tears and trephination channels at 1-day post-surgery. The tears were macroscopically visible at the time of necropsy at 1 day, 3, 6 weeks and 3 months and the edges of the tears were usually well apposed. A reddish repair tissue and signs of neo-vascularization were visible in chitosan-PRP treated knee at 6 weeks and 3 months and hybrids induced cell recruitment from the vascularized periphery of the menisci towards the trephination channels. Partial and total integration between the repair tissue and the original meniscal tissue was achieved in these treated knees. In addition, CS-PRP implants were well-tolerated in the knee environment and evidences of adverse effect did not observe during the follow-up period. Addition of wrapping technique by using of collagen membrane matrix of Chondro-Gide in conjunction with CS-PRP implants or PRP alone did not improve repair. In summary, our data suggest that chitosan-PRP implants by themselves could be efficient in overcoming the current limitations of meniscus repair and have several regenerative features that reveal a greater potential than PRP alone to improve repair outcomes and restore meniscus function. Our third aim was to assess I. The compatibility of freeze-dried chitosan formulations with different types of commercially marketed PRP systems, and II. Define a range of chitosan degree of deacetylation (DDA) and the number average molecular weight (Mn) that would yield freeze-dried formulations with satisfactory performance characteristics for clinical orthopedic conditions. Our starting hypothesis was that I. Chitosan formulations should be soluble and easily reconstituted in commercial PRPs, have paste-like properties and coagulate in a timely fashion to produce homogenous hybrid chitosan-PRP clots that resist retraction and are mechanically strong, and II. Although the different PRP preparation systems would yield PRPs with varying properties, all PRP preparations would be compatible with this technology. Formulations containing 1% w/v CS, 1% w/v trehalose as lyoprotectant, and 42.2 mM CaCl2 as a clot activator were prepared with five different chitosan, encompassing the low, mid, and high range of DDA and Mn product specifications were freeze-dried. Seven different PRP preparations were used to solubilize the formulations in vitro. Performance characteristics of chitosan-PRP formulations for clotting properties, runniness, liquid expression, paste-like properties, clot mechanical strength, and clot homogeneity were assessed. Also, solubility, pH, and osmolality of all the formulations were measured. Macroscopic assessment of cakes showed all the cakes were white, homogenous, and were slightly retracted from the vial walls following lyophilization. We found that freeze-dried formulations were solubilized with all PRP preparations. CS-PRP formulations were less runny than their corresponding PRP controls demonstrating its paste-like properties for in vivo injection. Assessment by thromboelastography revealed that all CS-PRP formulations had a clot reaction time below 9 minutes. In the static clotting assay, all PRP controls clotted, expressed serum, retracted, and lost their mass significantly, while the CS-PRP clots resisted platelet-mediated clot retraction. Histological results revealed that CS dispersion was homogeneous within CS-PRP clots. Our fourth objective was to optimize and reduce the freeze-drying (FD) cycle which has been historically used in our lab from 3 days to 1 or 2 days and to assess performance of the product with benchtop human PRP and human commercial plasma. Our starting hypotheses were that I. Freeze-drying cycle of CS formulations can be optimized to minimize overall freeze-drying time from 3 days to 1-2 days to produce cakes that will not collapse, II. FD cakes prepared with the shorter freeze-drying cycles would be soluble in benchtop human PRP to yield chitosan-PRP formulations which are paste-like, coagulate rapidly, and produce mechanically strong homogenous hybrid clots, and III. Commercial citrated plasma can be used instead of PRP to assess formulation performance. Formulations containing 1% w/v chitosan DDA 82-84% Mn 45-55 kDa with 1% w/v trehalose and 42.2 mM CaCl2 were prepared for freeze-drying. The same methodology was used as described above to assess performance characteristics of the freeze-dried cakes. The cakes that were non-collapsed were solubilized either in citrated pooled normal plasma or benchtop human PRP to assess different performance characteristics. CS-PRP formulations were less runny than their PRP controls and citrated pooled normal plasma. Data from thromboelastography machine revealed clot reaction time was shorter for chitosan-PRP formulation. Also, chitosan-PRP formulations resisted platelet-mediated clot retraction while PRP controls lost up to 80 % of their original mass in the glass tubes. Histological findings showed that chitosan was homogeneously dispersed within CS-PRP clots. In summary, our feasibility pilot studies in sheep showed promising results in terms of repair of complex defects by injection of chitosan-PRP that could be potentially translated to humans in the future. We refined the animal model and showed that animals could withstand implants for the duration of study with no deleterious effect to the other joint compartment, which suggests high safety. In addition, the chitosan formulations were shown to be compatible with several PRPs isolated with commercial systems. Lastly, optimization of freeze-drying cycles from 3 days to 1 day was successfully performed and formulations behaved as expected when solubilised in PRP or plasma.