Wide-Field Fluorescence Hyperspectral Imaging to Quantify Cell Populations in Spheroids Formed and Cultured in Microfluidic Chips

Le cancer de l'ovaire a le taux de mortalité le plus élevé de tous les cancers gynécologiques. Malgré les avancements en techniques de chirurgie et les développements en chimiothérapie au cours de la dernière décennie, son taux de survie après cinq ans demeure inférieur à 45%, en raison du diagnostic tardif de ce cancer et du phénomène de résistance aux médicaments. Les patients présentant un cancer épithélial de l'ovaire (CÉO), la forme la plus courante de la maladie, répondent généralement bien au traitement de chimiothérapie standard à base de platine et de taxane. Cependant, une forte proportion de patients rechute et cette récurrence se révèle souvent résistante au traitement standard. Une des hypothèses de cette résistance chez le CÉO est que son instabilité génétique élevée se traduit par une hétérogénéité clonale dans les tumeurs, où le nombre de clones (populations de cellules identiques) dans les tumeurs augmente avec le temps, créant de nouvelles mutations présentant différents niveaux de sensibilité aux traitements. Par exemple, le premier traitement de chimiothérapie d'une patiente peut tuer les clones sensibles et laisser une faible population de cellules résistantes qui finiront par croître et provoquer une rechute du cancer. Il est donc nécessaire d'étudier l'hétérogénéité clonale et ses effets sur la résistance aux médicaments. Divers modèles de cancer in vitro ont été développés pour la recherche en laboratoire. Le modèle le plus simple et le plus courant est la culture en monocouches bi-dimensionnelles (2D), pour laquelle les cellules cancéreuses adhèrent à une surface, comme les boîtes de pétri, et croissent en monocouche. Le modèle le plus réaliste consiste à utiliser directement les tumeurs de patients, car elles incluent le microenvironnement complet du cancer en trois dimensions (3D). Cependant, comme le tissu du patient est souvent disponible en quantités limitées, le nombre d'expériences qu'il est possible de faire est aussi limité. Les sphéroïdes sont des agrégats de cellules 3D formés in vitro et représentent un compromis idéal entre la simplicité, leur composition cellulaire étant connue et contrôlée, et le réalisme, car ils imitent mieux la nature 3D des tumeurs humaines que la culture en monocouches 2D. Les sphéroïdes peuvent facilement être utilisés pour étudier l'hétérogénéité clonale car plusieurs lignées cellulaires peuvent être mélangées à des ratios précis pour former des sphéroïdes de coculture. La communauté microfluidique a mis au point des puces microfluidiques qui peuvent facilement former et traiter des centaines de sphéroïdes. Dans ce projet, les puces microfluidiques sont utilisées pour réduire le travail en laboratoire en formant des dizaines de sphéroïdes en une seule étape et en les piégeant en place, de sorte que les changements de milieu de culture et de médicaments peuvent être rapidement effectués. L'un des principaux avantages de l'utilisation de sphéroïdes comme modèle de cancer in vitro est que des centaines de sphéroïdes de coculture identiques peuvent être utilisés pour étudier facilement diverses conditions. Cependant, l'analyse de la réponse dynamique de chacune des populations de cellules composant ce grand nombre de sphéroïdes reste un défi. Les études utilisent souvent la morphologie cellulaire, les marqueurs immunologiques ou les marqueurs fluorescents pour identifier les populations cellulaires. Mais beaucoup de ces techniques reposent sur l'observation directe de chaque cellule composant le sphéroïde et nécessitent soit une digestion du sphéroïde en une suspension cellulaire, soit une coupe du sphéroïde en fines tranches. Pour analyser des échantillons 3D intacts, des techniques de microscopie telles que la microscopie confocale, multiphotonique et à feuilles de lumière (light sheet microscopy) ont été développées. Bien qu'elles présentent de nombreux avantages, ces techniques ne sont pas adaptées pour analyser un haut nombre de sphéroïdes en une seule acquisition ou ne peuvent pas analyser les sphéroïdes de diamètres supérieurs à 70-100 µm. Au cours de ce doctorat, un système d'imagerie hyperspectrale (HSI) en fluorescence à large champ a été conçu, construit et validé pour l'étude de sphéroïdes en coculture. Le système HSI a été spécifiquement conçu pour imager plusieurs sphéroïdes en une seule acquisition et pour l'imagerie in situ de sphéroïdes dans des puces microfluidiques. La conception du système HSI, présentée dans l'article 1, repose sur l'utilisation d'un filtre accordable à cristaux liquides et d'une caméra à dispositif à transfert de charges à multiplication d'électrons (EMCCD) pour l'imagerie des sphéroïdes dans un champ de vision de 7,25 mm de diamètre. Un algorithme d'analyse d'image a également été développé pour compenser toute réponse du système influençant l'intensité de fluorescence mesurée pour chaque sphéroïde présent dans l'image. Une étape finale de quantification pour compenser les propriétés optiques de l'échantillon a également été développée et validée à l'aide de fantômes optiques. L'article 2 présente une méthodologie pour étudier l'hétérogénéité clonale et sa relation avec la réponse au traitement. Deux lignées cellulaires fluorescentes ont été dérivées de la même lignée cellulaire du cancer de l'ovaire et ont été utilisées pour former des sphéroïdes de coculture avec différents ratios d'ensemencement cellulaire initiaux. Les résultats montrent que le système HSI permet de suivre la croissance de chaque population cellulaire et sa réponse aux médicaments en fonction du temps, y compris pour les populations occupant seulement 10% des sphéroïdes. L'accaparement d'un clone par rapport à l'autre dans les sphéroïdes a également été observé lorsqu'une forte dose de chimiothérapie était utilisée pour traiter les sphéroïdes. Le système HSI a également pu mettre en évidence différentes dynamiques de réponse au médicament entre les deux populations de cellules. L'imagerie hyperspectrale en fluorescence à champ large est une technique idéale pour l'imagerie de plusieurs sphéroïdes en une seule acquisition. Sa résolution spectrale permet de quantifier un plus grand nombre de fluorophores que les cubes de filtres de microscopie standards. L'imagerie hyperspectrale pourrait également être utilisée pour étudier les sphéroïdes de coculture constitués de différents types de cellules, tels que les cellules épithéliales et stromales ou les cellules cancéreuses et immunitaires.