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Development of a Scalable Process for Lentiviral Vector Mass Production by Transient Transfection

Sven Ansorge

Ph.D. thesis (2010)

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Abstract

Lentiviral vectors (LVs) are promising delivery vehicles for applications in gene therapy. Yet, thefield still relies on inefficient and non-scalable production strategies. Current production methodswill become a limitation in later clinical evaluation phases and for commercialization when largeamounts of LVs need to be generated.In this work, we first reviewed current LV production methods and point out the constraintsintrinsic to these protocols. To date, routine LV production is almost exclusively performed insmall scale systems using adherent cells. These protocols will not be able to satisfy theanticipated future demands in LVs. For their widespread testing in clinical settings and for theproduction of LV-based therapeutics after their approval, novel scalable production strategies areneeded to robustly produce these vectors at high yield.An optimized protocol for LV production was developed using a HEK293 cell line grown insuspension cultures. In this scalable process, production in perfusion mode addressed the lowstability of functional LVs. Several strategies such as transfection at high cell density, selectionof advanced medium formulations and addition of the expression-enhancing additive sodiumbutyrate resulted in significant improvements of volumetric and specific productivity. The overallyield in functional LVs was increased by 100-fold and similar results were obtained for small andbioreactor scale cultures, reaching maximum functional LV titers in the range of 108 transducingunits (tu)/mL.The production kinetics under improved conditions was then analyzed employing several LVquantification methods. After transfection, highest functional LV titers were reproducibly found 2days post-transfection. The results also showed that LV quality, as the ratio of functional to totalLV particles was generally low with only 1-4 % of the total viral particles (measured as thenumber of viral genomes) being functional, i.e. having the ability to transfer genetic information.This ratio was not constant over time when sodium butyrate was added after transfection. LVquality was also increased at higher harvest rates. Our results also indicate that the cytotoxiceffects of VSV-G might be limiting for further yield improvements of the current LV productionsystem.

Résumé

Les vecteurs lentiviraux (LVs) sont considérés comme des véhicules de transfert prometteurspour des applications en thérapie génique. Cependant, il y a un manque évident de stratégies deproduction efficaces et transposables à grande échelle. En effet, les techniques actuelles deproduction ne pourront pas suffire à la génération du nombre de LVs nécessaires pour lesévaluations en phases cliniques et éventuellement pour leur commercialisation en cas de succèsdes essais.Dans ce travail, nous avons tout d'abord fait le point sur les méthodes actuelles de production desLVs et fait ressortir leurs contraintes intrinsèques. Jusqu'à ce jour, la production routinière deLVs se fait presqu'exclusivement à petite échelle avec des cellules adhérentes. Il est clair que cemode de production ne sera pas suffisant pour répondre aux demandes futures en LVs. Afin defaciliter les essais cliniques et la production de LVs à des fins thérapeutiques après certificationpar les autorités de règlementation, il apparaît important de mettre au point de nouvellesstratégies de production à grande échelle et permettant l'obtention de vecteurs à hautesconcentrations.Une technologie de production de LVs par transfection transitoire de cultures en suspension de lalignée cellulaire HEK293 a été développée. Dans ce procédé transposable à grande échelle,l'opération en mode perfusion a permis de résoudre la problématique associée à la faible stabilitéfonctionnelle des LVs. La combinaison de plusieurs approches, incluant la transfection à hautedensité cellulaire, la sélection de formulations avancées de milieux de culture et l'ajout debutyrate de sodium en tant qu'additif activateur d'expression, a permis d'augmentersignificativement les productivités volumétriques et spécifiques. Ainsi, il a été possibled'augmenter de 100 fois le taux de LVs fonctionnels, que ce soit à petite ou à grande échelle,permettant d'atteindre des titres fonctionnels maximaux en LVs avoisinant les 108 unités detransduction (tu)/mL.Les cinétiques de production ont été évaluées en utilisant plusieurs méthodes de quantificationdes LVs. Ainsi, on a pu observer que les titres maximaux en LVs fonctionnels sont atteints deuxjours après transfection. Ces résultats ont également démontré que la qualité des LVs produits (laqualité étant définie ici comme le rapport entre le nombre de LVs fonctionnels et le nombre deLVs totaux) était généralement faible : de l'ordre de 1 à 4 % du nombre de particules virales
Department: Department of Chemical Engineering
Program: Génie chimique
Academic/Research Directors: Olivier Henry, Amine Kamen
PolyPublie URL: https://publications.polymtl.ca/323/
Institution: École Polytechnique de Montréal
Date Deposited: 04 Oct 2010 14:52
Last Modified: 09 Nov 2022 00:15
Cite in APA 7: Ansorge, S. (2010). Development of a Scalable Process for Lentiviral Vector Mass Production by Transient Transfection [Ph.D. thesis, École Polytechnique de Montréal]. PolyPublie. https://publications.polymtl.ca/323/

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