Formation et caractérisation physico-chimique des complexes ADN/chitosane pour la thérapie génique

La thérapie génique est un secteur biomédical en plein essor et de nombreux vecteurs nonviraux à partir de polymères cationiques ont été étudiés pour la livraison de gènes. Le système de livraison de gènes doit condenser l'ADN, le protéger contre la dégradation par les nucléases, faciliter son entrée dans les cellules et transporter l'ADN jusqu'au noyau pour permettre l'expression des gènes. Ce projet consiste à approfondir notre compréhension d'un système prometteur pour la livraison de gènes: les complexes ADN/chitosane. Les objectifs principaux de cette thèse étaient de déterminer les interactions qui régissent la formation des complexes ADN/chitosane, de caractériser leurs propriétés physico-chimiques et d'étudier leur stabilité afin d'établir une corrélation avec leur efficacité de transfection. Dans un premier temps, l'association entre le chitosane et un ADN plasmide en fonction du pH, du degré de désacétylation (DDA) et de la masse molaire (Mn) du chitosane a été étudiée par microcalorimétrie de titrage isotherme (ITC). Cette étude nous a permis de déterminer la constante d'interaction, l'enthalpie d'interaction et la stoechiométrie des complexes. Nous avons trouvé que l'interaction chitosane-ADN est couplée avec un transfert de protons du système tampon au chitosane. Le transfert de proton est occasionné par la nature fortement anionique de l'ADN qui facilite l'ionisation des amines du chitosane lors de la complexation. De plus, nous avons démontré que l'enthalpie d'interaction mesurée était entièrement due aux changements d'ionisation du chitosane et du tampon. Nous avons trouvé une constante d'interaction chitosane-ADN de l'ordre de 109-1010 M-1 et qui augmente avec la diminution du pH. Ceci est attribué aux interactions électrostatiques plus intenses lorsque le degré d'ionisation du chitosane est plus élevé. Nous avons également mesuré une augmentation par dix de la constante d'affinité pour une augmentation de la masse molaire du chitosane de 7 à 153 kDa. Cette constante varie peu pour un DDA compris entre 72% et 80% (~80 kDa). En revanche, un DDA variant de 80 à 93% augmente la constante d'affinité pour atteindre une valeur proche du chitosane avec un Mn de 153 kDa et un DDA de 80%. Ces résultats montrent qu'il est possible de contrôler l'affinité chitosane-ADN par le pH et les caractéristiques moléculaires du chitosane. Cette étude a démontré que la formation des complexes ADN/chitosane est gouvernée par des interactions électrostatiques.

Abstract

In the first part of this thesis, the interaction of chitosan with plasmid DNA was investigated as a function of pH, buffer composition, degree of deacetylation (DDA) and molecular weight of chitosan, using isothermal titration microcalorimetry (ITC). The chitosan- DNA interaction was shown to be coupled with proton transfer from the buffer to chitosan. This proton transfer is induced by the strong polyanionic nature of DNA which facilitates the ionization of glucosamines of chitosan upon binding. The measured enthalpy of binding was almost entirely due to the ionization changes of the buffer and of chitosan. The chitosan-DNA binding constant was found in the range of 109-1010 M-1. The binding constant was pHdependent and was greater at lower pH due to increased electrostatic attraction to DNA when chitosan is highly charged. The binding constant between chitosan and plasmid DNA was significantly influenced by molecular weight and by DDA. The electrostatic effects were found to dictate the binding of chitosan to DNA. The results of this study provide insights into previously measured dependence of transfection efficiencies of DNA/chitosan complexes on chitosan DDA and molecular weight, where a balance between complex stability and chitosan-DNA binding strength was suggested to play a critical role. In the second study, we report a new approach to characterize DNA/polycation complexes using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) coupled online with UV/Vis spectroscopy, multi-angle light scattering (MALS), and dynamic light scattering (DLS). We demonstrated that this AF4 combined system can provide in a single measurement, three important physicochemical parameters of the complexes: the amount of unbound polycation, the hydrodynamic size of the complexes, and their size distribution. The accuracy of the particles sizes was confirmed by comparison with data from batch-mode DLS and scanning electron microscopy. Accurate quantification of unbound polycation can provide insight into the contribution of the free polycation in the process of gene delivery.