Bacterial Cellulose Supported Sensor for Bacteria and Gas Detection Development

Les intoxications dues à la consommation de produits alimentaires contaminés ont conduit à de nombreuses hospitalisations voire de nombreux décès mais ont également contribué à un énorme fardeau économique pour l'industrie alimentaire suite aux nombreux rappels et mise au rebus. Les méthodes traditionnelles (telles que les cultures microbiennes et croissances bactériennes) pour détecter les pathogènes sont relativement coûteuses et prennent beaucoup de temps et d'expertise à développer. De ce fait, il est devenu impératif de développer des approches de détection rapides et efficaces pour identifier la présence de bactérie(s) dans les aliments afin d'endiguer d'éventuelles épidémies rapidement. Le développement d'emballages alimentaires intelligents a considérablement évoluée récemment et génère de plus en plus d'intérêt afin de satisfaire les exigences des consommateurs et de l'industrie alimentaire, notamment dans tout ce qui a trait aux techniques de détection précoce de la présence de pathogènes et de bactéries. L'émergence de matériaux nanostructurés a eu un impact considérable sur les techniques de détections précises et rapides d'une molécule unique. De plus, la taille et les propriétés spécifiques des nanoparticules, nanofibres et autres en font des outils prometteurs pour améliorer les tests de détection dans de nombreux domaines tels que la médecine, l'environnement et bien sur, le secteur de l'alimentation. Des appareils miniaturisés, connus sous le nom de biosenseurs, facilitent la détection in situ de pathogènes alimentaires, ce qui donne à l'industrie de l'emballage un atout considérable pour la détection de ces bactéries. Ce travail de recherche se concentre sur le développement de senseurs basés sur des techniques de détections optiques (telles que colorimétrique et fluorescence) pour la détection de bactéries de façon directe via une cellule de détection ou de façon indirecte par la détection de ses sous produits, le tout pour des applications dans le domaine de l'alimentaire. Les senseurs optiques suggérés ont été intégrés à la surface d'une plateforme solide afin de l'adapter à la demande et aux exigences de l'industrie de l'emballage alimentaire. Ici, de la cellulose bactérienne ayant des propriétés remarquables comme une structure en nanofibrilles, une transparence optique, de bonnes propriétés mécaniques et une disponibilité des groupements fonctionnels a été considérée comme plateforme pour assurer la synthèse de nanoparticule et l'immobilisation de biomolécules.

La première partie de ce travail se concentre sur la détection de composés organiques volatils qui peuvent être générés suite à la croissance bactérienne. La méthode proposée consiste en l'utilisation de nanoparticules d'argent, dont les propriétés plasmoniques permettent une détection colorimétrique. Les nanoparticules d'argent sont donc synthétisées dans de la cellulose bactérienne via une procédure in situ qui résulte en la fabrication d'un nano-papier plasmonique dont les propriétés peuvent être hautement modulable uniquement par la modification de la distance entre les particules et/ou de leur taille. Les résultats ont démontré que les nanoparticules plasmoniques ainsi préparées sont très sensibles à des concentrations variées de vapeur d'ammoniaque. La détection précise de l'ammoniaque a été mesurée par absorbance UV-visible qui est associée aux propriétés plasmoniques des nanoparticules d'argent. Une réduction de l'intensité du pic plasmonique de l'argent a été observée lors de l'augmentation de la concentration en ammoniaque et de la durée d'exposition à ses vapeurs. Comme l'ammoniaque est un produit indicateur de contamination bactérienne dans la viande et le poisson, la plate-forme proposée permet la détection et le suivi de la contamination. Il a également été découvert que la taille des nanoparticules d'argent au sein de la cellulose bactérienne subit une réduction due à l'exposition à l'ammoniaque. Suite à ce phénomène, le nano-papier montre un changement de couleur, respectivement d'ambre foncé à ambre clair, au cours de l'interaction avec la vapeur d'ammoniaque, ou de gris à taupe en la présence de poisson ou de viande contaminée (dégageant de l'ammoniaque). Ces résultats prometteurs ouvrent toute une fenêtre d'opportunités pour le développement d'une technique de détection de contamination de la viande et du poisson par l'intermédiaire d'emballages intelligents. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons développé un biosenseur pour la détection de bactéries grâce à la méthode basée sur le principe de fluorescence. Ce biosenseur a été développé en utilisant la technique de transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (FRET) reposant sur le principe de Förster, une approche de transfert d'énergie non radiative entre un fuorophore photoexcité et une molécule dite accepteur et qui dépend fortement de la distance entre ces molécules. Parmi plusieurs paires de donneur-accepteur, le quantum dot nano-cristal et les nanoparticules d'or sont reconnus comme étant les plus efficaces dans la technique FRET. Au cours de la deuxième partie de ce travail de recherche, le développement d'un biosenseur pour la détection de bactéries a été étudié. Pour développer un biosenseur prometteur, une plate-forme sur une surface solide a été considérée avec les paramètres appropriés pour supporter la bio-reconnaissance des éléments. Il est apparu que la cellulose bactérienne imprégnée avec des nanoparticules d'or permet d'arriver à un système intéressant, soit d'obtenir des propriétés plasmoniques pour l'or et d'abondants groupes fonctionnels pour la cellulose bactérienne. Les résultats ont montré que la plate-forme peut ainsi absorber l'énergie de transfert d'un matériau fluorescent photo-excité, causant une réduction de leur photoluminescence. Cependant, la haute densité des nanoparticules d'or qui génère une capacité de réduction forte, si réduite, entrainera une réduction de cette capacité. Le nano-papier synthétisé présente une surface solide novatrice avec des capacités de désactivation qui peuvent être utilisées en détection par fluorescence comme le FRET. Dans la dernière partie de ce travail, un biosenseur pour la détection bactérienne a été développé basé sur les résultats obtenus au cours de la seconde partie de ce travail. Ce biosenseur a été développé en utilisant l'approche FRET. La cellulose bactérienne carboxylée mélangée avec des nanoparticules d'or sert d'accepteur et en même temps permet la liaison croisée avec l'élément de bio-reconnaissance de la plate-forme solide. Un point quantique (Quantum dot, QD) conjugué à l'anti E. coli joue le rôle de donneur qui se lie à la protéine A/G immobilisée à la surface de la cellulose bactérienne carboxylée. La photo-luminescence du QD génère une réaction de réduction une fois que l'anti E. coli conjugué avec le QD interagit avec la bactérie respective (E. coli). De ce fait, la distance entre le QD et la surface de l'accepteur est réduite, ce qui a pour conséquence le changement de conformation inhérent dans la structure de l'anticorps. Grâce à cette stratégie, E. coli a été détectée à la limite de la LOD près (Limite de Détection-Limit of Detection) qui se situe autour de 10 CFM.mL-1. Cet immuno-senseur identifie la bactérie directement sans autre traitement supplémentaire. Compte tenu de sa simplicité et de sa sélectivité, ce senseur a le potentiel d'être implanté en tant capteur dans un emballage alimentaire. Finalement, les résultats de ce projet de recherche sont multidisciplinaires et peuvent influencer plusieurs domaines de la science : 1) le secteur environnemental grâce à l'introduction d'une nouvelle génération d'emballages intelligents qui permettraient la reconnaissance précoce des pathogènes et des bactéries permettant de prévenir les infections; 2) la technologie des biosenseurs, en introduisant le nano-papier comme une plate-forme sensible et versatile pour la détection de vapeur; et 3) la simulation des propriétés intrinsèques d'un anticorps pour une détection directe d'antigènes.

Abstract

Foodborne outbreaks due to the consumption of contaminated food products result not only in hospitalization and death, but also place a large economical burden on the food industry due to product recall and disposal. Traditional methods (such as microbial cultures and bacterial growth) for detecting pathogens are relatively costly, time-consuming, and expert related. Therefore, rapid, accurate and in-situ approaches for identifying bacteria in the food industry are urgently needed to overcome the problem that can be widespread easily. Recently, smart food packaging has evolved to meet the demands of customers and food industries, especially in early recognition techniques of pathogens or spoilage bacteria. The emergence of nanostructured materials has had the greatest impact on the advancement of the most straightforward, quick and accurate detection of a single molecule. On the other hand, the size and unique properties of nanoparticles, nanofibers, nanorods, etc., make them promising tools for the improvement of recognition bioassay in various fields such as medicine, environment and food sectors. In this case, miniaturized devices, known as sensors, facilitate the in-situ detection of foodborne pathogens, benefiting the food packaging industry significantly. This research was addressed the development and demonstration of sensors based on optical techniques (e.g., colorimetric and fluorescent-based methods) for the detection of bacteria, directly through a whole cell or indirectly through its by-product. The suggested optical sensors were integrated to the surface of a solid platform to make it more compatible with demands in the food packaging. Here, bacterial cellulose with remarkable features such as the nanofibrils structures, optical transparency, mechanical properties and, availability of functional groups was considered as the platform, supporting the synthesis of nanoparticles and immobilization of biomolecules. The first part of this work focused on the detection of volatile organic compounds which may be produced during bacterial growth. The proposed method relied on using silver nanoparticle and its plasmonic properties, allowing a colorimetric technique. As such, the silver nanoparticles were synthesized within bacterial cellulose through an in-situ procedure that resulted in the fabrication of a plasmonic nanopaper, highly tunable by the change of size and interparticle distance. The results demonstrated that the prepared plasmonic nanoparticle is very sensitive to various concentrations of ammonia vapor. Interestingly, the precise detection of ammonia was measurable by the UV-vis absorbance spectra associated with the plasmonic properties of silver nanoparticles and trancparency of bacterial cellulose. Consequently, it revealed a reduction in the intensity of a plasmonic peak by increasing the concentration of ammonia and time of exposure. As ammonia is one of the primary compounds of bacterial spoilage in meat and fish, the proposed platform was assessed against the produced gases during spoilage. We also discovered that the size of silver nanoparticles embedded in the bacterial cellulose endured a reduction due to the etching by exposure to the ammonia. As observed, because of this phenomenon, the nanopaper exhibited a color change from amber to a light amber by interacting with ammonia vapor and, to a gray or taupe upon the presence of ammonia in fish spoilage or for meat, respectively. Thus, these results opened the window to an innovative technique for examining the spoilage in meat and fish by smart packaging. In the second part of this research, we studied the development of a biosensor for detection of bacteria relying on the fluorescent based-method. This biosensor was developed by using Förster (fluorescence) resonance energy transfer (FRET) approach that is a non-radiative energy transfer from a photoexcited fluorophore to an acceptor molecule with strong dependency on the distance between these molecules. Among various donor-acceptor pairs, nano-crystal quantum dot and gold nanoparticles are known as the high efficient ones in FRET technique. In order to design a promising biosensor, a solid surface platform was considered with the appropriate features to support the biorecognition and transducer elements. Interestingly, we found that bacterial cellulose impregnated with gold nanoparticles addressed the demands for such a system, owing to the plasmonic properties of gold nanoparticles (served as the acceptor) and abundant functional groups available in the bacterial cellulose. Our result showed that it functioned to absorb the energy transfer from photoexcited fluorescent materials, caused a reduction their photoluminescence. Accordingly, the high population density of gold nanoparticle-bacterial cellulose was intended as a strong quencher while this ability reduced by the reduction of the nanoparticle population density. Successfully, the synthesized nano paper presented a novel solid surface with quenching ability that can be utilized in fluorescence detection approaches such as FRET. In the last step, a biosensor for bacterial detection was assembled based on the obtained results from the pervious step of this research and by applying FRET approach. The carboxylated bacterial cellulose embedded with gold nanoparticles served as the acceptor and simultaneously cross-linked to the biorecognition element as the solid platform. Quantum dot (QD) conjugated to anti-E. coli played as the donor which bonded to the protein A/G immobilized on the surface of carboxylated bacterial cellulose. The photoluminescence of the QD endured a reduction once the anti-E. coli conjugated QD interacted with the respective bacteria. So, the distance between the QD and the surface of the acceptor was reduced, as the consequence of the inherent conformational change in the antibody structure after interacting. Through this strategy, E. coli was recognized with a LOD (limit of detection) about 10 CFM.mL-1. Thus, this immunosensor identified the bacteria directly without employing extra treatments. Given the simplicity and selectivity, the proposed biosensor has the potential to be implemented as a portable device in food packaging. Finally, the results of this research involve multidisciplinary and novel outcomes that can influence several fields of science. 1) the environmental sector, by introducing a new generation of smart packaging that allows early recognition of foodborne pathogens and spoilage bacteria to prevent infections outbreak, 2) biosensing technology, by introducing plasmonic nanopaper as a versatile and sensitive platform for the detection of vapor; and suggesting the intrinsic properties of an antibody for straightforward detection of antigens.