Large Scale Production, Purification, and Modification of Chitosan-Based Complexes for Gene Therapy

Le chitosane (CS) est un polymère cationique naturel qui s'associe aux acides nucléiques (AN), tels que les ARN interférents courts (siRNA), l'ADN plasmidique (pDNA) ou l'ARN messager (mRNA), pour former des complexes polyélectrolytes ou polyplexes non-solubles. Au cours des dernières années, les formulations de polyplexes à base de chitosane ont suscité un intérêt croissant en tant que systèmes de livraison d'acides nucléiques efficaces et sécuritaires, et ce pour des applications in vitro et in vivo. Les polyplexes CS/AN se forment par association électrostatique lorsque des solutions de CS et NA sont mélangées l'une avec l'autre. On utilise généralement le CS en excès par rapport aux AN, de telle sorte que les polyplexes portent une charge nette positive et suffisante pour assurer leur stabilité colloïdale. Malgré leur grand potentiel thérapeutique, les polyplexes à base de chitosane et leurs méthodes de production doivent être développés/optimisés davantage avant de pouvoir être utilisés pour des applications cliniques. Le mélange manuel est la méthode de production la plus courante des polyplexes CS/NA. Une telle méthode ne permet cependant pas un contrôle précis du processus de formation des complexes, pose donc des problèmes de variabilité/répétabilité entre utilisateurs/expérimentateurs et ne peut évidemment pas être utilisée à grande échelle. D'un autre côté, une fraction significative du CS utilisé en excès lors de la préparation des polyplexes demeure libre (non-lié aux polyplexes). Cette fraction de chitosane libre ainsi que la charge électrique positive des polyplexes favorisent les interactions avec les composants du sang et des systèmes physiologiques qui sont chargés négativement, ce qui limite la dose applicable de ces systèmes de livraison. L'application clinique de cette technologie de livraison par voie intravasculaire requièrt donc le développement de formulations avec une hémocompatibilité accrue. Le développement de telles formulations nécessite l'élimination de la fraction de CS libre et la modification des polyplexes avec, par exemple, le recouvrement de leur surface avec des polymères hydrophiles neutres ou des polyanions, de façon à neutraliser ou inverser le signe de la charge de ces complexes et ainsi éliminer/limiter les interactions avec les composantes du sang et améliorer leur pharmacocinétique. Dans le cadre de ce projet de doctorat, un système de mélange en ligne automatisé (SMLA) pour la production contrôlée et reproductible de larges volumes de polyplexes CS/AN a d'abord été développé. Le SMLA a permis la production de polyplexes CS/siRNA plus petits et plus homogènes par rapport à ceux obtenus par mélange manuel. Les polyplexes CS/siRNA produits à l'aide du SMLA en utilisant la vitesse de mélange maximale de 300 mL/min et une concentration de siRNA de 0.2 mg/mL, sont sphériques, plus petits et homogènes avec un diamètre hydrodynamique (Z-average) et un indice de polydispersite (PdI) de 47 nm et 0.12, respectivement, comparativement à des complexes préparés manuellement dont la taille est de l'ordre de 100 nm et le PdI de l'ordre de 0.2. Ces travaux de recherche ont permis de démontrer que les polyplexes CS/siRNA préparés à l'aide du SMLA ont une efficacité de silençage du gene de l'apolipoprotéine B (ApoB) in vitro équivalente ou supérieure à celle des polyplexes préparés par mélange manuel. Cette plate-forme de production à grande échelle automatisée permet de surmonter les limitations associées au mélange manuel des polyplexes et rend possible leur production contrôlée en grandes quantités pour des applications précliniques/cliniques. Afin de purifier de grands volumes de polyplexes à base de CS préparés à l'aide du SMLA, la filtration à flux tangentiel (TFF) basée sur l'utilisation de la technologie de fibres creuses a été adoptée et optimisée. Les paramètres d'opération optimaux de la TFF opérée en mode diafiltration ont été déterminés en utilisant des fibres creuses de polyethersulfone modifié (mPES) avec un poids moléculaire de coupure (MWCO) de 100 kDa: pression transmembranaire (TMP) de 0.9-1.0 psi, taux de cisaillement relativement faible allant de 7000 à 11000 s-1. Le rendement du procédé optimisé est de l'ordre de 85% avec une élimination du chitosane libre de plus de 98% et les résultats démontrent que les propriétés physico-chimiques des complexes ne sont pas altérées par la diafiltration. Les complexes de CS/siRNA ainsi purifiés ont été recouverts avec une librairie de molécules d'acide hyaluronique (HA) afin d'accroitre leur hémocompatibilité. Des HAs de masse molaire et degré de sulfatation (densité de charge) différents ont été utilisés. Les résultats démontrent que l'utilisation de HAs sulfatés ou non-sulfatés dans des proportions molaires de charges négatives du HA : charges négatives du siRNA supérieures ou égales à 2 :1 permet la production de polyplexes homogènes de faible taille et chargés négativement. De plus, l'utilisation de HA sulfatés permet d'obtenir des complexes plus stables par rapport à ceux préparés avec des HAs non-sulfatés. Finalement, nous avons déterminé que les polyplexes recouverts avec de HA non-sulfaté de masse molaire 10 kDa et de HA sulfaté de masse molaire 12 kDa (diamètres hydrodynamiques de 125 – 129 nm, PdI de 0.09 – 0.18 et potentiel zeta de 17 mV) possèdent une efficacité de silençage in vitro aussi élevée que celle de polyplexes CS/siRNA non recouverts de HA (non modifiés) et présentent une hémocompatibilité accrue par rapport aux complexes non-recouverts.

Globalement, ce travail de recherche a mené au développement d'une méthode contrôlée et reproductible de production à grande échelle de polyplexes à base de chitosane. Ces polyplexes possèdent une bioactivité équivalente ou supérieure en comparaison à celle de polyplexes préparés par mélange manuel. La purification de larges volumes de polyplexes par TFF, tout en préservant leurs propriétés physico-chimiques et leur bioactivité, constitue une autre réalisation importante de ce projet. L'ajout de molécules de HA à la surface de polyplexes suite à leur purification par TFF a mené au développement d'une nouvelle classe de complexes bioactifs avec une hémocompatibilité accrue. L'ensemble des résultats et développements de ce travail de recherche représentent un pas important pour l'utilisation future de polyplexes CS/AN dans des applications précliniques et cliniques.