Large Scale Production, Purification, and Modification of Chitosan-Based Complexes for Gene Therapy

Le chitosane (CS) est un polymère cationique naturel qui s'associe aux acides nucléiques (AN), tels que les ARN interférents courts (siRNA), l'ADN plasmidique (pDNA) ou l'ARN messager (mRNA), pour former des complexes polyélectrolytes ou polyplexes non-solubles. Au cours des dernières années, les formulations de polyplexes à base de chitosane ont suscité un intérêt croissant en tant que systèmes de livraison d'acides nucléiques efficaces et sécuritaires, et ce pour des applications in vitro et in vivo. Les polyplexes CS/AN se forment par association électrostatique lorsque des solutions de CS et NA sont mélangées l'une avec l'autre. On utilise généralement le CS en excès par rapport aux AN, de telle sorte que les polyplexes portent une charge nette positive et suffisante pour assurer leur stabilité colloïdale. Malgré leur grand potentiel thérapeutique, les polyplexes à base de chitosane et leurs méthodes de production doivent être développés/optimisés davantage avant de pouvoir être utilisés pour des applications cliniques. Le mélange manuel est la méthode de production la plus courante des polyplexes CS/NA. Une telle méthode ne permet cependant pas un contrôle précis du processus de formation des complexes, pose donc des problèmes de variabilité/répétabilité entre utilisateurs/expérimentateurs et ne peut évidemment pas être utilisée à grande échelle. D'un autre côté, une fraction significative du CS utilisé en excès lors de la préparation des polyplexes demeure libre (non-lié aux polyplexes). Cette fraction de chitosane libre ainsi que la charge électrique positive des polyplexes favorisent les interactions avec les composants du sang et des systèmes physiologiques qui sont chargés négativement, ce qui limite la dose applicable de ces systèmes de livraison. L'application clinique de cette technologie de livraison par voie intravasculaire requièrt donc le développement de formulations avec une hémocompatibilité accrue. Le développement de telles formulations nécessite l'élimination de la fraction de CS libre et la modification des polyplexes avec, par exemple, le recouvrement de leur surface avec des polymères hydrophiles neutres ou des polyanions, de façon à neutraliser ou inverser le signe de la charge de ces complexes et ainsi éliminer/limiter les interactions avec les composantes du sang et améliorer leur pharmacocinétique. Dans le cadre de ce projet de doctorat, un système de mélange en ligne automatisé (SMLA) pour la production contrôlée et reproductible de larges volumes de polyplexes CS/AN a d'abord été développé. Le SMLA a permis la production de polyplexes CS/siRNA plus petits et plus homogènes par rapport à ceux obtenus par mélange manuel. Les polyplexes CS/siRNA produits à l'aide du SMLA en utilisant la vitesse de mélange maximale de 300 mL/min et une concentration de siRNA de 0.2 mg/mL, sont sphériques, plus petits et homogènes avec un diamètre hydrodynamique (Z-average) et un indice de polydispersite (PdI) de 47 nm et 0.12, respectivement, comparativement à des complexes préparés manuellement dont la taille est de l'ordre de 100 nm et le PdI de l'ordre de 0.2. Ces travaux de recherche ont permis de démontrer que les polyplexes CS/siRNA préparés à l'aide du SMLA ont une efficacité de silençage du gene de l'apolipoprotéine B (ApoB) in vitro équivalente ou supérieure à celle des polyplexes préparés par mélange manuel. Cette plate-forme de production à grande échelle automatisée permet de surmonter les limitations associées au mélange manuel des polyplexes et rend possible leur production contrôlée en grandes quantités pour des applications précliniques/cliniques. Afin de purifier de grands volumes de polyplexes à base de CS préparés à l'aide du SMLA, la filtration à flux tangentiel (TFF) basée sur l'utilisation de la technologie de fibres creuses a été adoptée et optimisée. Les paramètres d'opération optimaux de la TFF opérée en mode diafiltration ont été déterminés en utilisant des fibres creuses de polyethersulfone modifié (mPES) avec un poids moléculaire de coupure (MWCO) de 100 kDa: pression transmembranaire (TMP) de 0.9-1.0 psi, taux de cisaillement relativement faible allant de 7000 à 11000 s-1. Le rendement du procédé optimisé est de l'ordre de 85% avec une élimination du chitosane libre de plus de 98% et les résultats démontrent que les propriétés physico-chimiques des complexes ne sont pas altérées par la diafiltration. Les complexes de CS/siRNA ainsi purifiés ont été recouverts avec une librairie de molécules d'acide hyaluronique (HA) afin d'accroitre leur hémocompatibilité. Des HAs de masse molaire et degré de sulfatation (densité de charge) différents ont été utilisés. Les résultats démontrent que l'utilisation de HAs sulfatés ou non-sulfatés dans des proportions molaires de charges négatives du HA : charges négatives du siRNA supérieures ou égales à 2 :1 permet la production de polyplexes homogènes de faible taille et chargés négativement. De plus, l'utilisation de HA sulfatés permet d'obtenir des complexes plus stables par rapport à ceux préparés avec des HAs non-sulfatés. Finalement, nous avons déterminé que les polyplexes recouverts avec de HA non-sulfaté de masse molaire 10 kDa et de HA sulfaté de masse molaire 12 kDa (diamètres hydrodynamiques de 125 – 129 nm, PdI de 0.09 – 0.18 et potentiel zeta de 17 mV) possèdent une efficacité de silençage in vitro aussi élevée que celle de polyplexes CS/siRNA non recouverts de HA (non modifiés) et présentent une hémocompatibilité accrue par rapport aux complexes non-recouverts.

Globalement, ce travail de recherche a mené au développement d'une méthode contrôlée et reproductible de production à grande échelle de polyplexes à base de chitosane. Ces polyplexes possèdent une bioactivité équivalente ou supérieure en comparaison à celle de polyplexes préparés par mélange manuel. La purification de larges volumes de polyplexes par TFF, tout en préservant leurs propriétés physico-chimiques et leur bioactivité, constitue une autre réalisation importante de ce projet. L'ajout de molécules de HA à la surface de polyplexes suite à leur purification par TFF a mené au développement d'une nouvelle classe de complexes bioactifs avec une hémocompatibilité accrue. L'ensemble des résultats et développements de ce travail de recherche représentent un pas important pour l'utilisation future de polyplexes CS/AN dans des applications précliniques et cliniques.

Abstract

Chitosan (CS) is a naturally derived cationic polysaccharide which simply self-assembles with nucleic acids (NAs) to form non-soluble polyelectrolyte complexes. In recent years, CS-based polyplex formulations have gained increasing interest as safe and efficient non-viral gene delivery systems both in vitro and in vivo. CS/NA polyplexes are produced by electrostatic-mediated association upon mixing of CS and NA solutions while CS is in excess versus NA. Thus, the final polyplexes bear a net positive charge that electrostatically stabilize them. Despite their great therapeutic potential, CS-based polyplexes must be further improved before transferring for clinical applications. Manual mixing is the most common method to produce CS-based polyplexes. However, this method varies in implementation, which raises concerns regarding comparability of the final polyplexes. Nonetheless, independent of the adopted approach, the conventional manual mixing is not only a poorly controlled method that results in irreproducibility but it is also restricted to relatively small volumes, which poses risks of batch to batch and inter-user variability. On the other hand, upon mixing of CS and NA, a significant portion of CS remains unbound to polyplexes. Due to interactions with negatively charged blood components, the unbound CS as well as the positive surface of polyplexes limit the applicable dosage of these therapeutics. Hence, clinical application of this technology requires development of hemocompatible formulations for intravenous (IV) delivery systems. Development of formulations with increased hemocompatibility involves coating the polyplexes either with another hydrophilic neutral polymer, e.g. polyethylene glycol (PEG), or with another polyanion, e.g. Hyaluronic Acid (HA), to switch the surface charge in order to eliminate the interactions with blood cells, and finally enhance the pharmacokinetics of CS-based polyplexes. Before these polyplexes can be used for further surface modifications, and studied clinically for IV administration they must be purified. Purification of CS-based polyplexes relies on elimination of the unbound CS molecules from the polyplexes. This work initially established a fully automated in-line mixing system (AIMS) for production of large batches of CS-based polyplexes. CS/siRNA polyplexes produced via AIMS were predominantly spherical, with z-average diameter as small as 47 nm, polydispersity index (PDI) as low as 0.12, and zeta potential of +16 mV, when prepared at the highest possible mixing speed (300mL/min), and siRNA concentration of 0.2mg/mL. Thus, AIMS was capable to deliver even smaller and more monodisperse CS/siRNA polyplexes compared to manual polyplexes with z-average of 100 nm and PDI of 0.20). It was also demonstrated that the in-line mixed CS/siRNA polyplexes have equivalent or higher silencing efficiency of Apolipoprotein B (ApoB) in HepG2 cells, compared to manually prepared polyplexes. This scaled-up platform addressed the risk of batch to batch inter-user and intra-user variability, resulting in a controlled quality of large quantities of polyplexes intended for pre-clinical and clinical applications. Furthermore, to concentrate and purify large batches of CS-based polyplexes, tangential flow filtration (TFF) was adopted based on hollow fiber technology. Optimal TFF operational conditions were established using 100kD modified polyethersulfone (mPES) hollow fibers: trans-membrane pressure (TMP) of 0.9-1.0 psid, and relatively low shear rates of 7000-11000 s-1. Upon establishment of the operational conditions, it was demonstrated that TFF is capable in concentration of polyplexes up to sevenfold while preserving their physico-chemical properties. Optimal number of diafiltration volumes (DV) for diafiltration of polyplexes was also studied. Our data showed that when system ran at the shear rate of 7000 s-1, more than 98% of the unbound CS was removed with a DV of 5, while recovery yield was as high as 85%. Moreover, no marked changes in physico-chemical properties and morphology of polyplexes were observed post-diafiltration. Purified CS/siRNA eGFP polyplexes were then coated by a library of HA molecules to enhance their hemocompatibility. HAs with different molecular weights and degrees of sulfation, at different phosphate to carboxyl ratios (C:P) were tested. It was found that a high molecular weight HA (866 kDa) results in macroscopic flocculations at every C:P ratio tested. Moreover, for low molecular weight HA (10-40 kDa) or moderate molecular weight HA (148-168 kDa), C:P≥ 2 is needed to effectively coat the polyplexes and switch the surface charge of complexes. Our data showed that polyplexes coated with lower molecular weight HAs, non-sulfated 10kDa and sulfated 12 kDa have have even higher knockdown efficiency of eGFP in H1299 cells (75-82%), compared to the uncoated polyplexes (53-63%). Furthermore, it was shown that although both sulfated and non-sulfated HAs result in small sized, homogenous and bioactive complexes, sulfated HA molecules present higher stability during filtration process. However, for both non-sulfated and sulfated HAs, coated formulations demonstrated improved hemocompatibility compared to the uncoated polyplexes. This work allowed to develop a controlled method for reproducible production of large batches of CS-based polyplexes with equivalent bioactivity as compared to manually prepared polyplexes. Purification of large batches of polyplexes via TFF while preserving their physicochemical properties, and their biological activity was another accomplishment of this work. Moreover, adding a HA-coating to polyplexes led to the development of a new class of bioactive complexes with increased hemocompatibility. These results represent an important step towards future clinical use of CS-based intravenous gene therapies.