Freeze-Dried Chitosan Platelet-Rich Plasma Hybrids for Rotator Cuff Tear Repair

Les déchirures de la coiffe du rotateur sont une des blessures musculo-squelettiques les plus répandues de l'épaule. Les techniques de réparation chirurgicales actuellement utilisées échouent dans environ 20 à 95% des cas dépendamment de l'âge, la taille, du tabagisme, du temps de guérison, de la qualité du tendon, de la qualité musculaire, de la réponse à la guérison et des traitements chirurgicaux. La majorité des déchirures chroniques des tendons surviennent principalement dans le supraspinatus, ce qui mène à des changements structurels tels que l'accumulation de gras, la perte de volume, le remodelage musculaire, la disparition de sarcomères et, parfois, une faiblesse musculaire profonde. Trouver un modèle animal similaire à l'humain est un défi de taille mais très utile pour améliorer notre compréhension des voies cellulaires et moléculaires impliquées dans la pathologie de la coiffe du rotateur. Les pathologies du tendon sont aggravées par son potentiel de guérison limité, attribué à la présence de changements dégénératifs et à une vascularité relativement faible. Le développement de nouvelles technologies pour traiter les déchirures de la coiffe du rotateur nécessite également des tests sur des modèles animaux afin d'évaluer l'innocuité et l'efficacité du traitement, avant d'effectuer des tests cliniques pour éventuellement améliorer les options de traitement thérapeutique. Il est donc important d'évaluer les modèles animaux utilisés pour la recherche des pathologies de la coiffe du rotator; Idéalement, ceux-ci présenteraient une dégénérescence des tendons, une atrophie musculaire et une infiltration de gras similaire à celle de l'humain. Notre premier but était donc de recenser les traitements cliniques actuels utilisés pour guérir la coiffe du rotateur, de décrire les nouvelles stratégies en cours de développement clinique et préclinique. Nos résultats ont demontré qu'aucun animal n'a une anatomie comparable à celle des humains. Bien que les dernières techniques de sutures semblent augmenter le taux de guérisson des tendons, ceci n'a pas été traduit par une amélioration des résultats cliniques. Les patches de matrix extracellulaire n'ont pas démontrées de résultats prometteurs dans les essaies cliniques randomisés. Il n'existe encore aucune étude sur la réparation de la coiffe du rotateur utilisant des facteurs de croissances chez l'humain. L'utilisation de PRP en orthopédie est encore controversée et malheureusement aucunes des stratégies actuellement utilisées améliore la réparation des déchirures de la coiffe du rotateur. Une solution possible pourrait être l'utilisation d'implants de chitosan-PRP. En résumé, plusieurs stratégies de réparation sont disponibles, mais d'autres essais cliniques sont nécessaires pour trouver le traitement optimal pour la réparation de la coiffe du rotateur. Les implants de chitosane (CS)-PRP ont démontrés qu'ils pouvaient améliorer la réparation du ménisque, de la coiffe du rotateur et la réparation du cartilage dans des modèles précliniques. Cela nous a conduits à étudier les mécanismes d'action in vitro et in vivo des implants CS-PRP. Des formulations lyophilisées contenant 1% (p / v) de chitosane (80% désacétylé et masse moléculaire moyenne de 38 kDa), 1% (p / v) de trehalose, un lyoprotectant, et 42,2 mM de chlorure de calcium, l'activateur de caillot, ont été solubilisés dans du PRP. L'objectif de cette étude était d'étudier les mécanismes possibles par lesquels le chitosan inhibe la rétraction des caillots hybrides CS-PRP in vitro, caractériser l'effet du chitosan, du tréhalose et une combinaison sur l'activation plaquettaire et la sécrétion granulaire in vitro, caractériser le profil de libération de PDGF-AB et EGF à partir de caillots hybrides CS-PRP in vitro, et d'évaluer histologiquement la résidence, la bioactivité et la biodégradabilité des implants CS-PRP in vivo. Nos hypothèses de départ étaient que (1) le chitosane se lierait aux plaquettes d'une manière non spécifique inhibant l'agrégation plaquettaire dans les caillots hybrides et la rétraction du caillot médiée par les plaquettes; (2) le chitosane activerait les plaquettes et induirait la sécrétion des granules; (3) la libération de facteurs de croissances à faible point isoélectrique (chargé négativement à pH neutre), comme EGF, serait plus soutenue par les implants de CS-PRP que la libération de facteurs de croissances avec des points isoélectriques élevés (chargés positivement à pH neutre), tel PDGF-AB, en raison d'interactions électrostatiques avec le chitosane cationique; (4) Les implants CS-PRP résideraient beaucoup plus longtemps que le PRP seul in vivo, où ils induiraient le recrutement cellulaire et l'angiogenèse, mais seraient également dégradés à l'intérieur de 6 semaines. Nos images confocales, SEM et TEM soutiennent notre première hypothèse selon laquelle le chitosan recouvre physiquement les plaquettes et autres composants du caillot sanguin pour inhiber l'agrégation plaquettaire, nécessaire pour la rétraction du caillot. Dans les caillots hybrides, le chitosane interfère physiquement avec la capacité des plaquettes à adhérer l'une à l'autre ainsi qu'au réseau de fibrine, exerçant ainsi des forces mécaniques. Nos deuxième et troisième objectifs visaient à déterminer si les plaquettes étaient activées dans les caillots hybrides CS-PRP et, dans l'affirmative, comment les facteurs de croissances dérivés des plaquettes sont libérés des caillots hybrides CS-PRP. Conformément à notre troisième hypothèse, nous avons constaté que le chitosane induisait l'activation des plaquettes et la sécrétion des granules dans les suspensions cellulaires, même plus que l'ADP, un agoniste plaquettaire connu. Fait intéressant, l'incubation de la suspension cellulaire avec tréhalose et chitosane a légèrement diminué l'expression de Pac-1 et de p-sélectine par rapport à l'incubation avec du chitosane seul. Même si les conditions d'essai dans le dosage de cytométrie en flux sont différentes du caillot hybride, nous avons prévu que les plaquettes dans les caillots hybrides CS-PRP seraient activées et libèreraient leur granules, ce qui a été déterminé par des tests ELISA. Notre troisième hypothèse de depart, était que le point isoélectrique des facteurs de croissance dérivés des plaquettes déterminerait comment les facteurs de croissance seraient libérés des hybrides CS-PRP. Le point isoélectrique du PDGF est de 9,8 et dans des conditions physiologiques, nous nous attendions à une répulsion ionique entre le PDGF-AB chargé positivement et le chitosane cationique qui provoquerait une libération rapide et courte. Pendant ce temps, on s'attendait à ce qu'EGF, avec un point isoélectrique de 4,6, se lirait au chitosane dans des conditions physiologiques et serait libéré de manière plus continue. Contrairement à cela, nous avons constaté que les caillots hybrides CS-PRP ont soutenu et augmenté la libération de PDGF-AB et d'EGF pendant 1 semaine in vitro, ce qui suggére que d'autres facteurs supplémentaires contrôlent leur libération dans ce système in vivo. Nous avons aussi constaté que les niveaux cumulatifs de PDGF-AB et EGF libérés dans le milieu de culture étaient plus élevés dans les caillots CS-PRP par rapport aux caillots PRP. En ce qui concerne la libération des facteurs de croissance, il est important de considérer la contribution de chaque type de cellule présente dans la préparation PRP. Les plaquettes sont les principaux contributeurs à la libération de facteurs de croissance du PRP et des corrélations positives ont déjà été trouvées entre les doses de plaquettes et la quantité de facteurs de croissance libérés, y compris PDGF-AB, TGF-β1, VEGF et EGF. Notre quatrième objectif était d'étudier les implants in vivo, et nous avons demontré qu'ils présentaient une résidence plus longue et une bioactivité plus élevée que le PRP. En résumé, le chitosan enrobe physiquement les plaquettes, les cellules sanguines et les brins de fibrine dans les implants CS-PRP, ce qui inhibe l'agrégation plaquettaire, nécessaire pour la rétraction du caillot. Les plaquettes sont activées, granules sécrétées et des niveaux plus élevés de PDGF-AB et d'EGF sont libérés à partir de caillots CS-PRP par rapport aux caillots PRP in vitro. Enfin, les implants CS-PRP résident pendant au moins 6 semaines après implantation sous-cutanée et induisent le recrutement cellulaire et la synthèse de tissue de granulation, confirmant une résidence plus longue et une bioactivité plus élevée par rapport au PRP in vivo. L'objectif de la troisième étude était d'évaluer si les implants CS-PRP étaient capables d'améliorer la réparation des dechirures de la coiffe du rotateur dans un modèle de lapin. Des déchirures complètes ont été créées bilatéralement dans le tendon supraspinatus (SSP) des lapins blancs de Nouvelle Zéalande (n = 4 dans une étude de faisabilité pilote suivie de n = 13 dans une étude d'efficacité plus large), qui ont été réparés à l'aide de sutures transosseuses. Du côté traité, les implants CS-PRP ont été injectés dans les tunnels transosseux et dans le tendon lui-même, et la guérison a été évaluée histologiquement à des points temporels allant de 1 à 2 mois après la chirurgie. Nos hypothèses de départ étaient les suivantes: 1) Les implants CS-PRP induiraient le recrutement de cellules polymorphonucléaires (PMN) à des moments précoces après la chirurgie, 2) Les implants CS-PRP seraient dégradés 2 mois après la chirurgie et 3) Les implants CS-PRP amélioreraient la réparation des déchirures de la coiffe du rotateur grâce à une augmentation du recrutement cellulaire, de l'angiogenèse et du remodelage osseux. L'un de nos objectifs était de déterminer la répartition de l'implant et d'évaluer la dégradation de l'implant au fil du temps. Un jour après la chirurgie, les implants CS-PRP résidaient à l'intérieur du creux osseux, dans les tunnels latéraux et également sur les surfaces du tendon. Les implants CS-PRP ont également inhibé l'ossification hétérotopique du tendon SSP à 2 mois tout en favorisant la fixation du tendon SSP à la tête humérale grâce à un remodelage osseux accru à la tuberosité supérieure. Les implants CS-PRP ont induit le recrutement de PMNs à des moments précoces après la chirurgie, soutenant notre première hypothèse. Contrairement à la deuxième hypothèse, la dégradation des implants et les réactions inflammatoires associées étaient encore en cours dans 3 sur 9 épaules traitées à 2 mois. Les résultats ont partiellement soutenu notre troisième hypothèse selon laquelle CS-PRP améliorerait la réparation de la coiffe du rotateur, en améliorant la fixation du tendon SSP grâce à un remodelage osseux amélioré. De manière inattendue, de petites zones de tissu de granulation riche en neutrophiles entourant les tissus apoptotiques / nécrotiques étaient visibles dans 3 épaules traitées avec CS-PRP à 2 mois. La suppression de l'ossification hétérotopique du tendon SSP (HO) par le traitement CS-PRP a été une découverte inattendue dans cette étude. Cette étude semble fournir des preuves que les implants CS-PRP sont sans danger et efficaces pour améliorer la réparation des déchirures de la coiffe du rotateur dans un petit modèle animal et que cela pourrait être traduit dans un contexte clinique. L'objectif de la quatrième étude était d'étudier l'effet de l'utilisation d'implants de CS-PRP en conjonction avec des ancres de suture dans des modèles de déchirure de la coiffe du rotateur ovins aigus et chroniques et voir si cela pouvait améliorer la réparation de la coiffe du rotateur. Dans deux études de faisabilité, des déchirures unilatérales de pleine épaisseur ont été créées dans le tendon de l'infraspinatus (ISP) de brebis. Dans le modèle chronique (n = 4 brebis), les tendons ont été recouverts d'une membrane de silicone permettant une dégénération chronique pendant 6 semaines, tandis que les tendons ont été réparés immédiatement dans le modèle aigu (n = 4 brebis). Les tendons ISP transectés ont été rattachés à des ancres de suture et dans le cas des épaules traitées; Les implants composés de CS lyophilisé solubilisés dans du PRP autologue ont été appliqués en plus sur l'interface tendon-os et sur le site réparé. Le modèle chronique a induit une dégénérescence et une rétraction importante du tendon et du muscle, ce qui a rendu la réparation beaucoup plus difficile que dans le modèle aigu. Le traitement par implants CS-PRP a induit le recrutement de cellules polymorphonucléaires à 2 semaines post-opératoires et a également amélioré l'organisation structurelle du tendon ISP à 3 mois. Le traitement a également augmenté le remodelage osseux et la croissance interne à l'interface tendon-os à 3 mois, ce qui suggère qu'une fixation plus robuste pourrait être obtenue en combinant les implants CS-PRP et les ancres de suture. Ces études pilotes fournissent la première preuve que les implants CS-PRP peuvent améliorer la réparation des déchirures de la coiffe du rotateur dans de grands modèles animaux. Notre hypothèse de départ a été partiellement soutenue par le fait que le traitement avec des sutures d'ancrage + CS-PRP a conduit à une amélioration de l'apparence structurelle du tendon, à un remodelage osseux et une croissance accrue à la jonction tendon-os. Nous avons constaté que recouvrir les tendons pendant 6 semaines avec des membranes de silicone de 5 cm empêchait probablement une diffusion adéquate d'éléments nutritifs et entraînait une mort cellulaire et une dégénérescence sévère du tendon lui-même, ce qui a rendu certains tendons non réparables. Bien que la dégénérescence n'ait pas été aussi marquée lorsque les tendons ont été recouverts pendant 2 semaines avec une membrane de silicone de 5 mm, le rattachage à l'empreinte initiale aurait été difficile à atteindre puisque l'unité tendineuse avait considérablement rétracté. Nous avons constaté que les tissus cicatriciels abondants comblaient l'écart entre le tendon et la tuberosité après 2 et 6 semaines. À partir de maintenant, nous considérons que le modèle de réparation aiguë est plus cohérent et facilement reproductible que le modèle chronique. Des cellules polymorphonucléaires (PMN) ont été observées dans le tissue de réparation du tendon de l'épaule traité avec des ancres + CS-PRP 2 semaines post-implantation. Le tendon traité avec des ancres a seulement montré de la chondrogénèse et l'expression de GAG dans le corps du tendon à 6 semaines, alors que ce n'était pas le cas avec le tendon traité avec les ancres + CS-PRP. De manière inattendue, la technique de réparation des ancrages + CS-PRP a entraîné un meilleur résultat structurel du tendon que les ancres seules à 3 mois, probablement par une modulation du moment de la séquence de guérison ou par un remodelage des tissues de réparation accru. Il n'y avait aucun effet délétère spécifique au traitement dans l'articulation de l'épaule, ce qui suggère que les implants CS-PRP sont sécuritaires. Les anomalies structurelles étaient visibles dans la plupart des glénoïdes, ce qui suggère que des contraintes plus importantes sont appliquées sur cette surface par rapport à la tête humérale dans le modèle des brebis. L'infiltration de gras dans le muscle ISP a été induite dans les modèles à la fois chronique et aiguë, et aucun traitement n'a pu inverser cet effet. Une synovite transitoire légère était présente dans l'épaule traitée avec CS-PRP à 2 semaines, ce qui a été résolu à 6 semaines et 3 mois, une fois que le biomatériau a été dégradé. En résumé, les techniques de développement pour augmenter la réparation de la coiffe du rotateur restent cliniquement pertinentes. Les défis techniques associés au modèle de réparation chronique chez les brebis rendent le modèle aïgu plus préférable pour les études futures. Ces deux études pilotes fournissent la première preuve que les implants CS-PRP améliorent la réponse de guérison chez les grands modèles animaux de réparation de la coiffe du rotateur, en partie grâce à un remodelage osseux accru au tissu de réparation du tendon et à l'interface osseuse sous-jacente.