Freeze-Dried Chitosan Platelet-Rich Plasma Hybrids for Rotator Cuff Tear Repair

Les déchirures de la coiffe du rotateur sont une des blessures musculo-squelettiques les plus répandues de l'épaule. Les techniques de réparation chirurgicales actuellement utilisées échouent dans environ 20 à 95% des cas dépendamment de l'âge, la taille, du tabagisme, du temps de guérison, de la qualité du tendon, de la qualité musculaire, de la réponse à la guérison et des traitements chirurgicaux. La majorité des déchirures chroniques des tendons surviennent principalement dans le supraspinatus, ce qui mène à des changements structurels tels que l'accumulation de gras, la perte de volume, le remodelage musculaire, la disparition de sarcomères et, parfois, une faiblesse musculaire profonde. Trouver un modèle animal similaire à l'humain est un défi de taille mais très utile pour améliorer notre compréhension des voies cellulaires et moléculaires impliquées dans la pathologie de la coiffe du rotateur. Les pathologies du tendon sont aggravées par son potentiel de guérison limité, attribué à la présence de changements dégénératifs et à une vascularité relativement faible. Le développement de nouvelles technologies pour traiter les déchirures de la coiffe du rotateur nécessite également des tests sur des modèles animaux afin d'évaluer l'innocuité et l'efficacité du traitement, avant d'effectuer des tests cliniques pour éventuellement améliorer les options de traitement thérapeutique. Il est donc important d'évaluer les modèles animaux utilisés pour la recherche des pathologies de la coiffe du rotator; Idéalement, ceux-ci présenteraient une dégénérescence des tendons, une atrophie musculaire et une infiltration de gras similaire à celle de l'humain. Notre premier but était donc de recenser les traitements cliniques actuels utilisés pour guérir la coiffe du rotateur, de décrire les nouvelles stratégies en cours de développement clinique et préclinique. Nos résultats ont demontré qu'aucun animal n'a une anatomie comparable à celle des humains. Bien que les dernières techniques de sutures semblent augmenter le taux de guérisson des tendons, ceci n'a pas été traduit par une amélioration des résultats cliniques. Les patches de matrix extracellulaire n'ont pas démontrées de résultats prometteurs dans les essaies cliniques randomisés. Il n'existe encore aucune étude sur la réparation de la coiffe du rotateur utilisant des facteurs de croissances chez l'humain. L'utilisation de PRP en orthopédie est encore controversée et malheureusement aucunes des stratégies actuellement utilisées améliore la réparation des déchirures de la coiffe du rotateur. Une solution possible pourrait être l'utilisation d'implants de chitosan-PRP. En résumé, plusieurs stratégies de réparation sont disponibles, mais d'autres essais cliniques sont nécessaires pour trouver le traitement optimal pour la réparation de la coiffe du rotateur. Les implants de chitosane (CS)-PRP ont démontrés qu'ils pouvaient améliorer la réparation du ménisque, de la coiffe du rotateur et la réparation du cartilage dans des modèles précliniques. Cela nous a conduits à étudier les mécanismes d'action in vitro et in vivo des implants CS-PRP. Des formulations lyophilisées contenant 1% (p / v) de chitosane (80% désacétylé et masse moléculaire moyenne de 38 kDa), 1% (p / v) de trehalose, un lyoprotectant, et 42,2 mM de chlorure de calcium, l'activateur de caillot, ont été solubilisés dans du PRP. L'objectif de cette étude était d'étudier les mécanismes possibles par lesquels le chitosan inhibe la rétraction des caillots hybrides CS-PRP in vitro, caractériser l'effet du chitosan, du tréhalose et une combinaison sur l'activation plaquettaire et la sécrétion granulaire in vitro, caractériser le profil de libération de PDGF-AB et EGF à partir de caillots hybrides CS-PRP in vitro, et d'évaluer histologiquement la résidence, la bioactivité et la biodégradabilité des implants CS-PRP in vivo. Nos hypothèses de départ étaient que (1) le chitosane se lierait aux plaquettes d'une manière non spécifique inhibant l'agrégation plaquettaire dans les caillots hybrides et la rétraction du caillot médiée par les plaquettes; (2) le chitosane activerait les plaquettes et induirait la sécrétion des granules; (3) la libération de facteurs de croissances à faible point isoélectrique (chargé négativement à pH neutre), comme EGF, serait plus soutenue par les implants de CS-PRP que la libération de facteurs de croissances avec des points isoélectriques élevés (chargés positivement à pH neutre), tel PDGF-AB, en raison d'interactions électrostatiques avec le chitosane cationique; (4) Les implants CS-PRP résideraient beaucoup plus longtemps que le PRP seul in vivo, où ils induiraient le recrutement cellulaire et l'angiogenèse, mais seraient également dégradés à l'intérieur de 6 semaines. Nos images confocales, SEM et TEM soutiennent notre première hypothèse selon laquelle le chitosan recouvre physiquement les plaquettes et autres composants du caillot sanguin pour inhiber l'agrégation plaquettaire, nécessaire pour la rétraction du caillot. Dans les caillots hybrides, le chitosane interfère physiquement avec la capacité des plaquettes à adhérer l'une à l'autre ainsi qu'au réseau de fibrine, exerçant ainsi des forces mécaniques. Nos deuxième et troisième objectifs visaient à déterminer si les plaquettes étaient activées dans les caillots hybrides CS-PRP et, dans l'affirmative, comment les facteurs de croissances dérivés des plaquettes sont libérés des caillots hybrides CS-PRP. Conformément à notre troisième hypothèse, nous avons constaté que le chitosane induisait l'activation des plaquettes et la sécrétion des granules dans les suspensions cellulaires, même plus que l'ADP, un agoniste plaquettaire connu. Fait intéressant, l'incubation de la suspension cellulaire avec tréhalose et chitosane a légèrement diminué l'expression de Pac-1 et de p-sélectine par rapport à l'incubation avec du chitosane seul. Même si les conditions d'essai dans le dosage de cytométrie en flux sont différentes du caillot hybride, nous avons prévu que les plaquettes dans les caillots hybrides CS-PRP seraient activées et libèreraient leur granules, ce qui a été déterminé par des tests ELISA. Notre troisième hypothèse de depart, était que le point isoélectrique des facteurs de croissance dérivés des plaquettes déterminerait comment les facteurs de croissance seraient libérés des hybrides CS-PRP. Le point isoélectrique du PDGF est de 9,8 et dans des conditions physiologiques, nous nous attendions à une répulsion ionique entre le PDGF-AB chargé positivement et le chitosane cationique qui provoquerait une libération rapide et courte. Pendant ce temps, on s'attendait à ce qu'EGF, avec un point isoélectrique de 4,6, se lirait au chitosane dans des conditions physiologiques et serait libéré de manière plus continue. Contrairement à cela, nous avons constaté que les caillots hybrides CS-PRP ont soutenu et augmenté la libération de PDGF-AB et d'EGF pendant 1 semaine in vitro, ce qui suggére que d'autres facteurs supplémentaires contrôlent leur libération dans ce système in vivo. Nous avons aussi constaté que les niveaux cumulatifs de PDGF-AB et EGF libérés dans le milieu de culture étaient plus élevés dans les caillots CS-PRP par rapport aux caillots PRP. En ce qui concerne la libération des facteurs de croissance, il est important de considérer la contribution de chaque type de cellule présente dans la préparation PRP. Les plaquettes sont les principaux contributeurs à la libération de facteurs de croissance du PRP et des corrélations positives ont déjà été trouvées entre les doses de plaquettes et la quantité de facteurs de croissance libérés, y compris PDGF-AB, TGF-β1, VEGF et EGF. Notre quatrième objectif était d'étudier les implants in vivo, et nous avons demontré qu'ils présentaient une résidence plus longue et une bioactivité plus élevée que le PRP. En résumé, le chitosan enrobe physiquement les plaquettes, les cellules sanguines et les brins de fibrine dans les implants CS-PRP, ce qui inhibe l'agrégation plaquettaire, nécessaire pour la rétraction du caillot. Les plaquettes sont activées, granules sécrétées et des niveaux plus élevés de PDGF-AB et d'EGF sont libérés à partir de caillots CS-PRP par rapport aux caillots PRP in vitro. Enfin, les implants CS-PRP résident pendant au moins 6 semaines après implantation sous-cutanée et induisent le recrutement cellulaire et la synthèse de tissue de granulation, confirmant une résidence plus longue et une bioactivité plus élevée par rapport au PRP in vivo. L'objectif de la troisième étude était d'évaluer si les implants CS-PRP étaient capables d'améliorer la réparation des dechirures de la coiffe du rotateur dans un modèle de lapin. Des déchirures complètes ont été créées bilatéralement dans le tendon supraspinatus (SSP) des lapins blancs de Nouvelle Zéalande (n = 4 dans une étude de faisabilité pilote suivie de n = 13 dans une étude d'efficacité plus large), qui ont été réparés à l'aide de sutures transosseuses. Du côté traité, les implants CS-PRP ont été injectés dans les tunnels transosseux et dans le tendon lui-même, et la guérison a été évaluée histologiquement à des points temporels allant de 1 à 2 mois après la chirurgie. Nos hypothèses de départ étaient les suivantes: 1) Les implants CS-PRP induiraient le recrutement de cellules polymorphonucléaires (PMN) à des moments précoces après la chirurgie, 2) Les implants CS-PRP seraient dégradés 2 mois après la chirurgie et 3) Les implants CS-PRP amélioreraient la réparation des déchirures de la coiffe du rotateur grâce à une augmentation du recrutement cellulaire, de l'angiogenèse et du remodelage osseux. L'un de nos objectifs était de déterminer la répartition de l'implant et d'évaluer la dégradation de l'implant au fil du temps. Un jour après la chirurgie, les implants CS-PRP résidaient à l'intérieur du creux osseux, dans les tunnels latéraux et également sur les surfaces du tendon. Les implants CS-PRP ont également inhibé l'ossification hétérotopique du tendon SSP à 2 mois tout en favorisant la fixation du tendon SSP à la tête humérale grâce à un remodelage osseux accru à la tuberosité supérieure. Les implants CS-PRP ont induit le recrutement de PMNs à des moments précoces après la chirurgie, soutenant notre première hypothèse. Contrairement à la deuxième hypothèse, la dégradation des implants et les réactions inflammatoires associées étaient encore en cours dans 3 sur 9 épaules traitées à 2 mois. Les résultats ont partiellement soutenu notre troisième hypothèse selon laquelle CS-PRP améliorerait la réparation de la coiffe du rotateur, en améliorant la fixation du tendon SSP grâce à un remodelage osseux amélioré. De manière inattendue, de petites zones de tissu de granulation riche en neutrophiles entourant les tissus apoptotiques / nécrotiques étaient visibles dans 3 épaules traitées avec CS-PRP à 2 mois. La suppression de l'ossification hétérotopique du tendon SSP (HO) par le traitement CS-PRP a été une découverte inattendue dans cette étude. Cette étude semble fournir des preuves que les implants CS-PRP sont sans danger et efficaces pour améliorer la réparation des déchirures de la coiffe du rotateur dans un petit modèle animal et que cela pourrait être traduit dans un contexte clinique. L'objectif de la quatrième étude était d'étudier l'effet de l'utilisation d'implants de CS-PRP en conjonction avec des ancres de suture dans des modèles de déchirure de la coiffe du rotateur ovins aigus et chroniques et voir si cela pouvait améliorer la réparation de la coiffe du rotateur. Dans deux études de faisabilité, des déchirures unilatérales de pleine épaisseur ont été créées dans le tendon de l'infraspinatus (ISP) de brebis. Dans le modèle chronique (n = 4 brebis), les tendons ont été recouverts d'une membrane de silicone permettant une dégénération chronique pendant 6 semaines, tandis que les tendons ont été réparés immédiatement dans le modèle aigu (n = 4 brebis). Les tendons ISP transectés ont été rattachés à des ancres de suture et dans le cas des épaules traitées; Les implants composés de CS lyophilisé solubilisés dans du PRP autologue ont été appliqués en plus sur l'interface tendon-os et sur le site réparé. Le modèle chronique a induit une dégénérescence et une rétraction importante du tendon et du muscle, ce qui a rendu la réparation beaucoup plus difficile que dans le modèle aigu. Le traitement par implants CS-PRP a induit le recrutement de cellules polymorphonucléaires à 2 semaines post-opératoires et a également amélioré l'organisation structurelle du tendon ISP à 3 mois. Le traitement a également augmenté le remodelage osseux et la croissance interne à l'interface tendon-os à 3 mois, ce qui suggère qu'une fixation plus robuste pourrait être obtenue en combinant les implants CS-PRP et les ancres de suture. Ces études pilotes fournissent la première preuve que les implants CS-PRP peuvent améliorer la réparation des déchirures de la coiffe du rotateur dans de grands modèles animaux. Notre hypothèse de départ a été partiellement soutenue par le fait que le traitement avec des sutures d'ancrage + CS-PRP a conduit à une amélioration de l'apparence structurelle du tendon, à un remodelage osseux et une croissance accrue à la jonction tendon-os. Nous avons constaté que recouvrir les tendons pendant 6 semaines avec des membranes de silicone de 5 cm empêchait probablement une diffusion adéquate d'éléments nutritifs et entraînait une mort cellulaire et une dégénérescence sévère du tendon lui-même, ce qui a rendu certains tendons non réparables. Bien que la dégénérescence n'ait pas été aussi marquée lorsque les tendons ont été recouverts pendant 2 semaines avec une membrane de silicone de 5 mm, le rattachage à l'empreinte initiale aurait été difficile à atteindre puisque l'unité tendineuse avait considérablement rétracté. Nous avons constaté que les tissus cicatriciels abondants comblaient l'écart entre le tendon et la tuberosité après 2 et 6 semaines. À partir de maintenant, nous considérons que le modèle de réparation aiguë est plus cohérent et facilement reproductible que le modèle chronique. Des cellules polymorphonucléaires (PMN) ont été observées dans le tissue de réparation du tendon de l'épaule traité avec des ancres + CS-PRP 2 semaines post-implantation. Le tendon traité avec des ancres a seulement montré de la chondrogénèse et l'expression de GAG dans le corps du tendon à 6 semaines, alors que ce n'était pas le cas avec le tendon traité avec les ancres + CS-PRP. De manière inattendue, la technique de réparation des ancrages + CS-PRP a entraîné un meilleur résultat structurel du tendon que les ancres seules à 3 mois, probablement par une modulation du moment de la séquence de guérison ou par un remodelage des tissues de réparation accru. Il n'y avait aucun effet délétère spécifique au traitement dans l'articulation de l'épaule, ce qui suggère que les implants CS-PRP sont sécuritaires. Les anomalies structurelles étaient visibles dans la plupart des glénoïdes, ce qui suggère que des contraintes plus importantes sont appliquées sur cette surface par rapport à la tête humérale dans le modèle des brebis. L'infiltration de gras dans le muscle ISP a été induite dans les modèles à la fois chronique et aiguë, et aucun traitement n'a pu inverser cet effet. Une synovite transitoire légère était présente dans l'épaule traitée avec CS-PRP à 2 semaines, ce qui a été résolu à 6 semaines et 3 mois, une fois que le biomatériau a été dégradé. En résumé, les techniques de développement pour augmenter la réparation de la coiffe du rotateur restent cliniquement pertinentes. Les défis techniques associés au modèle de réparation chronique chez les brebis rendent le modèle aïgu plus préférable pour les études futures. Ces deux études pilotes fournissent la première preuve que les implants CS-PRP améliorent la réponse de guérison chez les grands modèles animaux de réparation de la coiffe du rotateur, en partie grâce à un remodelage osseux accru au tissu de réparation du tendon et à l'interface osseuse sous-jacente.

Abstract

Rotator cuff tears are the most common musculoskeletal injury occurring in the shoulder. Current surgical repair fails to heal in 20 to 95% of cases depending on age, size, smoking, time of repair, tendon quality, muscle quality, healing response, and surgical treatments. The majority of chronic tendon tears occurs mostly in the supraspinatus and ultimately leads to structural changes such as fatty accumulation, loss of volume, muscle remodeling, subtraction of sarcomeres, and sometimes, profound muscle weakness. Finding the right animal model is challenging but critically important to improve our understanding of the cellular and molecular pathways involved in rotator cuff pathology. These problems are worsened by the limited healing potential of injured tendons, attributed to the presence of degenerative changes and relatively poor vascularity of the cuff tendons. Development of new techniques to treat rotator cuff tears also requires testing in animal models to assess safety and efficacy prior to clinical testing to improve therapeutic treatment options. Hence it is important to evaluate appropriate animal models for rotator cuff research with degeneration of tendons, muscular atrophy and fatty infiltration similar to humans. Our first purpose was to review current clinical treatments and new repair strategies under development both clinically and pre-clinically. Our findings showed that none of the animals have anatomy comparable to humans. Although the latest suture techniques seem to somewhat increase the rate of tendon healing, this has not been translated into improved clinical and functional outcomes. Extracellulaire matrix (ECM) patches have not shown promising results in randomized clinical trials and scaffolds still need clinical studies. Still no study exists on rotator cuff repair using growth factors in humans. Platelet-rich plasma (PRP) use in orthopedics is still controversial and none of these strategies enhance rotator cuff tear repair. One possible effective technique could be using chitosan-PRP implants. In summary, several repair strategies are available but further clinical trials are needed to find the optimal treatment for rotator cuff repair. Chitosan (CS)-PRP implants have been shown to improve meniscus and cartilage repair in pre-clinical models. This has led us to investigate in vitro and in vivo mechanisms of action of CS-PRP implants. Our second purpose was to investigate possible mechanisms by which chitosan inhibits retraction of CS-PRP hybrid clots in vitro, characterize the effect of chitosan, trehalose and a combination of both on platelet activation and granule secretion in vitro, characterize the release profile of PDGF-AB and EGF from CS-PRP hybrid clots in vitro, and histologically assess the residency, bioactivity and biodegradability of CS-PRP implants in vivo. Our starting hypotheses were that (1) chitosan would bind to platelets in a non-specific way inhibiting platelet aggregation in hybrid clots and platelet-mediated clot retraction; (2) chitosan would activate platelets and induce granule secretion; (3) the release of growth factors with low isoelectric point (negatively charged at neutral pH), such as EGF, would be more sustained from CS-PRP hybrids than the release of growth factors with high isoelectric points (positively charged at neutral pH), such as PDGF-AB, due to electrostatic interactions with cationic chitosan; (4) CS-PRP implants would reside longer than PRP in vivo, where they would induce cell recruitment and angiogenesis, but would be degraded within 6 weeks. Confocal, SEM and TEM images supported our first hypothesis that chitosan physically coats platelets and other components of the blood clot to inhibit platelet aggregation, needed for clot retraction. In the hybrid clots, chitosan physically interferes with the ability of the platelets to adhere to each other and the fibrin network, hence exerting mechanical forces. Our second and third aims were to investigate whether platelets are activated in CS-PRP hybrid clots and, if so, how platelet-derived growth factors are released from CS-PRP hybrid clots. Consistent with our third hypothesis, we found that chitosan induces platelet activation and granule secretion in cell suspensions, even more so than ADP, a known platelet agonist. Interestingly, incubation of cell suspension with trehalose along with chitosan slightly decreased expression of Pac-1 and p-selectin compared to incubation with chitosan alone. Even though test conditions in the flow cytometry assay are different than in the hybrid clot system, we expected platelets within the CS-PRP hybrid clots to be activated and release their granule content, and this was ascertained by ELISA assays. Our third starting hypothesis was that the isoelectric point of platelet-derived growth factors would determine how growth factors would be released from our CS-PRP hybrids. The isoelectric point of PDGF is 9.8 and, under physiological conditions, we expected ionic repulsion between positively charged PDGF-AB and cationic chitosan to result in burst release. Meanwhile, EGF, which has an isoelectric point of 4.6, would be expected to bind to chitosan under physiological conditions and be released in a more sustained manner. In contrast to this, we found that CS-PRP hybrid clots sustained and increased release of both PDGF-AB and EGF for 1 week in vitro, which suggested that additional factors are controlling their release in this system. We found that cumulative levels of PDGF-AB and EGF released in the culture medium were higher in the case of CS-PRP clots compared to PRP clots. With regard to growth factor release, it is important to consider the contribution of each cell type present in the PRP preparation. Platelets are the main contributors to growth factor release from PRP and positive correlations were previously found between platelet doses and the amount of released growth factors including PDGF-AB, TGF-1, VEGF and EGF. Our fourth aim was to investigate the implants in vivo, and they were shown to exhibit longer residency and higher bioactivity than PRP. In summary, chitosan physically coats platelets, blood cells and fibrin strands in CS-PRP hybrid clots, thus inhibiting platelet aggregation, which is required for clot retraction. Platelets are activated; granules secreted and higher levels of PDGF-AB and EGF are released from CS-PRP hydrid clots compared to PRP clots in vitro. Finally, CS-PRP implants reside for at least 6 weeks post-implantation subcutaneously and induce cell recruitment and granulation tissue synthesis, confirming a longer residency and higher bioactivity compared to PRP in vivo. Our third purpose was to assess whether CS-PRP implants were capable of improving rotator cuff tear repair in a rabbit model. Complete tears were created bilaterally in supraspinatus (SSP) tendons of New Zealand White rabbits (n=4 in a pilot feasibility study followed by n=13 in a larger efficacy study), which were repaired using transosseous suturing. On the treated side, CS-PRP implants were additionally injected into the transosseous tunnels and the tendon itself, and healing was assessed histologically at time points ranging from 1 day to 2 months post-surgery. Our starting hypotheses were that: 1) CS-PRP implants would induce recruitment of polymorphonuclear cells (PMN) at early time points post-surgery, 2) CS-PRP implants would be degraded by 2 months post-surgery, and 3) CS-PRP implants would improve transosseous rotator cuff repair through an increase in cell recruitment, angiogenesis and bone remodeling. One of our objectives was to determine implant distribution and assess implant degradation over time. At 1 day post-surgery, CS-PRP implants were resident inside the bony trough, in the lateral tunnels and also adhered to tendon surfaces. CS-PRP implants inhibited heterotopic ossification of the SSP tendon at 2 months while also favoring attachment of the SSP tendon to the humeral head through increased bone remodelling at the greater tuberosity. CS-PRP implants induced PMN recruitment at early time points post-surgery, supporting our first hypothesis. In contrast to the second hypothesis, implant degradation and associated inflammatory reactions were still ongoing in 3 out of 9 treated shoulders at 2 months. Results partially supported our third hypothesis that CS-PRP would improve rotator cuff tear repair, since treatment improved SSP tendon attachment through increased bone remodeling. Unexpectedly, small areas of neutrophil-rich granulation tissue surrounding apoptotic/necrotic tissues were visible in 3 CS-PRP treated shoulders at 2 months. The suppression of SSP tendon heterotopic ossification (HO) by CS-PRP treatment was an unexpected finding in this study. The bony trough was incompletely healed in some rabbits at 2 months. This study seems to provide evidence that CS-PRP implants are safe and effective in improving rotator cuff tear repair in a small animal model, and that this could potentially be translated into clinical setting. Our fourth purpose was to investigate the effect of using CS- PRP implants in conjunction with suture anchors in chronic and acute ovine rotator cuff tear models and see if it can improve rotator cuff repair. In two subsequent pilot feasibility studies, unilateral full-thickness tears were created in the infraspinatus (ISP) tendons of mature female Texel-Cross sheep. In the chronic model (n=4 sheep), the tendons were capped with silicone and allowed to degenerate to chronic stage for 6 weeks, while the tendons were immediately repaired in the acute model (n=4 sheep). Transected ISP tendons were reattached with suture anchors and, in the case of treated shoulders; implants composed of freeze-dried CS solubilized in autologous PRP were additionally applied to the tendon-bone interface and on top of the repaired site. The chronic defect model induced significant tendon degeneration and retraction, which made repair more challenging than in the acute defect model. Treatment with CS-PRP implants induced recruitment of polymorphonuclear cells at 2 weeks post-operatively and improved ISP tendon structural organization at 3 months. Treatment also increased bone remodeling and ingrowth at the tendon-bone interface at 3 months, suggesting that a more robust attachment could be achieved by combining CS-PRP implants with suture anchors. Our starting hypothesis was supported in that treatment with anchors + CS-PRP implants led to improved tendon structural appearance and increased bone remodeling and ingrowth at the tendon-bone junction. We found that capping the ISP tendons for 6 weeks with 5-cm silicone tubes likely prevented proper nutrient diffusion and led to cell death and severe tendon degeneration, which rendered some tendons unrepairable. Although degeneration was not as marked when the tendons were capped for 2 weeks with 5-mm silicone length, reattachment at the footprint would have been difficult to achieve since the tendon-muscle unit had significantly retracted. We found that abundant scar tissues were bridging the gap between the capped tendon and the tuberosity after 2 weeks and 6 weeks. As of now, we consider the acute repair model to be more consistent and easily reproducible. Polymorphonuclear (PMN) cells were observed in the tendon repair tissue of the shoulder treated with anchors + CS-PRP for 2 weeks. The tendon treated with anchors only showed chondrogenesis and GAG expression within the tendon body at 6 weeks, while the tendon treated with anchors + CS-PRP did not. Unexpectedly, the anchors + CS-PRP repair technique resulted in better tendon structural outcome than anchors only at 3 months, possibly through a modulation of timing of the healing sequence or through increased repair tissue remodeling. There were no treatment-specific deleterious effects in the shoulder joints, suggesting that CS-PRP implants have high safety. Structural abnormalities were visible in most glenoids, suggesting that greater stresses are applied on that surface compared to the humeral head in sheep. Fatty infiltration of the ISP muscle was induced in both chronic and acute models, and no treatment was able to reverse that effect. Mild transient synovitis was present in the shoulder treated with CS-PRP at 2 weeks, and this was resolved at the later 6 weeks and 3 months time points, once the biomaterial was degraded. In summary, developing techniques to augment of rotator cuff repair remains clinically relevant. The technical challenges associated with the chronic repair model in the sheep make the acute model more preferable for future studies. These pilot studies provide the first evidence that CS-PRP implants improve the healing response in large animal models of rotator cuff repair, partly through increased bone remodeling at the tendon repair tissue and underlying bone interface.