High-Yield Production Process of Influenza Virus-Like Particles in Human Cells Toward Large-Scale Vaccine Manufacturing

Le virus influenza a été la cause d'épidémies et de pandémies parmi les plus anciennes et meurtrières rapportées dans l'histoire de l'humanité. La vaccination est le moyen le plus efficace de prévenir les infections. Par contre, la fabrication actuelle des vaccins contre l'influenza se fait dans les oeufs, avec des embryons de poulet, un procédé lent et laborieux qui limite la capacité de répondre efficacement en cas de pandémie ou suite à une forte demande pour la grippe saisonnière. De plus, ces vaccins induisent principalement une réponse humorale contre les antigènes dominants hémagglutinine (HA) et neuraminidase (NA), deux protéines du virus, causant un manque de protection croisée contre certaines des nouvelles souches. Leur efficacité est également réduite chez certains groupes plus vulnérables (par ex. personnes âgées et jeunes enfants). Par conséquent, l'industrie se tourne vers le développement d'une nouvelle gamme de vaccins plus immunogéniques et produits à partir de plateformes plus efficaces. Les particules pseudo-virales (Virus-like particles en anglais, VLPs) constituent une alternative intéressante comme vaccin. Les VLPs présentent une structure qui s'apparente à celle des virus de type sauvage, en permettant la présentation à leur surface des antigènes principaux, dans leur conformation native. De plus, les particules pseudo-virales sont non-infectieuses et incapables de se répliquer. Les cellules de mammifères offrent plusieurs avantages comme plateforme d'expression pour la synthèse de nombreux produits biopharmaceutiques; elles sont capables d'effectuer des modifications post-traductionnelles complexes, de croître à haute densité et de produire des VLPs en suspension et en bioréacteur. Jusqu'à maintenant, les études traitant des VLPs influenza (produites avec des cellules de mammifères) se sont concentrées principalement sur l'assemblage du virion et sur le mécanisme de bourgeonnement cellulaire, alors que seulement un nombre limité d'études porte sur leur production à grande échelle et leur emploi potentiel comme vaccin. Dans le cadre de cette thèse, un bioprocédé transposable à grande échelle pour produire des quantités importantes de VLPs chimériques Gag-influenza à partir de cellules HEK-293 (cellules de reins issues d'un embryon humain) a été développé. En premier lieu, nous avons généré une lignée cellulaire HEK-293 exprimant de façon stable les protéines HA et NA (souche H1N1 du virus Influenza) sous le contrôle d'un système inductible au cumate. Ensuite, la formation des VLPs chimériques a été induite et dirigée par la transfection de plasmides codant la protéine Gag du virus de l'immunodéficience humaine ou la protéine M1, vii une composante de la matrice du virus de l'influenza. La protéine Gag a été fusionnée à la protéine fluorescente verte pour faciliter le suivi de la production des VLPs. Les protéines antigéniques ont été produites 7 fois plus efficacement en présence de la protéine Gag, ce qui indique qu'il s'agit d'une meilleure protéine structurale que M1 dans ce contexte. Par conséquent, la production de VLPs contenant HA-NA et Gag (par transfection) a donc été transférée à l'échelle d'un bioréacteur de 3L avec agitation. Les VLPs ont été recueillies par ultracentrifugation sur un coussin de sucrose, puis concentrées par filtration à flux tangentiel en employant une membrane ayant des pores d'une taille limite de 1000 kDa. Plusieurs techniques ont été employées pour caractériser les VLPs produites: immunodiffusion radiale simple, essai d'hémagglutination, immunobuvardage de type Western et dot blot, ainsi que la microscopie électronique à transmission. Par ailleurs, lors d'essais sur des animaux, l'immunisation intranasale à partir de VLPs a permis d'induire une réponse immunitaire spécifique en plus de conférer une protection totale à toutes les souris soumises à l'épreuve (100% d'efficacité) avec une souche homologue de l'influenza. Après avoir démontré l'efficacité des VLPs comme vaccin in vivo (démonstration de faisabilité), une nouvelle lignée cellulaire inductible a été développée, exprimant cette fois les trois protéines HA, NA et Gag fusionnée à la GFP. Le but de générer une telle lignée était de simplifier le procédé de production en éliminant l'étape de transfection transitoire, qui peut être laborieuse à conduire à grande échelle. Sans sacrifier la production spécifique, le procédé a été optimisé pour obtenir une plus grande production volumétrique en augmentant notamment la densité cellulaire au moment de l'induction et en employant un mode de perfusion. L'opération a été réalisée à l'aide d'un bioréacteur de 3L et d'une filtration à flux tangentiel subséquente permettant d'augmenter les rendements de VLPs de 60 fois (3x1011 Gag-GFP événements fluorescents/L de culture mesurés par cytométrie de flux) en comparaison à une production sans perfusion (5x109 Gag-GFP événements fluorescents/L). Le procédé a été caractérisé en déterminant la cinétique de production des protéines d'intérêts présentes dans les VLPs (le procédé en amont) ainsi que le taux de récupération pour chaque opération unitaire de la purification (le procédé en aval). L'opération du bioréacteur, en mode de perfusion et avec la lignée stable 293-HA/NA/Gag-GFP, a permis d'obtenir 5 fois plus de protéines antigéniques HA dans les VLPs que le bioréacteur opéré sans perfusion où la transfection transitoire a été employée. Le nouveau procédé développé viii a permis de générer des rendements supérieurs à ceux publiés jusqu'à ce jour pour des VLPs influenza produits à partir de cellules de mammifères. Finalement, dans le but de répondre à certaines préoccupations de biosécurité associées à un usage potentiel de VLPs comme vaccins (parce que ce sont des particules enveloppées qui bourgeonnent d'une cellule hôte et qui renferment des protéines cellulaires, de l'ADN et de l'ARN), nous avons effectué une caractérisation du protéome des VLPs Gag-influenza produites par transfection transitoire et des vésicules extracellulaires produites par des cellules HEK-293 de type sauvage. Les fonctions des protéines identifiées dans les VLPs et dans les vésicules extracellulaires ont été discutées. Le procédé développé dans le cadre de cette thèse devrait être efficace pour produire des VLPs exposant les protéines HA et NA issues de différentes souches d'influenza. Les VLPs produites pourraient être évaluées dans le cadre d'essais cliniques dans le but de conduire au développement d'un vaccin efficace et sécuritaire pour remplacer ou complémenter le procédé actuel de production dans les embryons poulets.

Abstract

Of the fatal infections noted in human history, influenza epidemics and pandemics are among the most ancient. Vaccination remains the most effective tool to prevent infection. However, the current production of influenza vaccines in embryonated chicken eggs has limited capacity during pandemics or high demand seasons, and is both labor-intensive and time-consuming. Furthermore, the seasonal egg-produced vaccines mainly induce humoral response to the Hemagglutinin (HA)/Neuraminidase (NA) dominant antigens, which leads to a lack of cross-protection against other non-matching novel strains. In addition, the vaccines provide low protection in high risk groups (e.g., elderly and young children). Consequently, the industry is moving toward the development of novel, more immunogenic influenza vaccines as well as more efficient production platforms. Virus-like particles (VLPs) constitute a promising alternative as influenza vaccine. They mimic the particulate structure of wild-type viruses while they are non-infectious, non-replicative particles, and the main antigens repetitively displayed on their surface maintain the native conformation. Mammalian cell culture offers several advantages for the production of biopharmaceuticals such as their ability to perform complex post-translational modifications and the high cell densities and productivities reached in suspension culture bioreactors. Up to now, the production of influenza VLPs from mammalian cells has been mostly addressed to study influenza assembly and budding mechanisms but little attention has been paid to its potential use for large-scale manufacturing of VLPs as influenza vaccine candidate. The aim of this thesis was to develop a scalable process to produce large quantities of chimeric influenza Gag-VLPs from stable human embryonic kidney HEK-293 cells in suspension culture. First, a HEK-293 cell line stably expressing HA and NA proteins of influenza (subtype H1N1) under the regulation of the inducible cumate system was established. Then, the formation of VLPs was mediated by transient transfection of plasmids encoding human immunodeficiency virus (HIV) Gag or M1 influenza matrix protein. Gag protein was fused to the green fluorescent protein (GFP) to facilitate the monitoring of VLPs production. VLP antigenic proteins were produced seven times more efficiently in the presence of Gag, indicating that Gag is a better scaffolding protein than M1 in this context. Subsequently, the production of HA-NA containing VLPs after transient transfection of Gag as scaffold protein was successfully implemented in a 3-L controlled stirred tank bioreactor. VLPs were recovered by ultracentrifugation on a sucrose x cushion followed by concentration through tangential flow filtration (TFF) using a 1000 KDa cut-off membrane. Different techniques were employed to characterize the produced VLPs: Single radial immunodiffusion (SRID), hemagglutination assay, dot-blot, western-blot, and transmission electron microscopy (TEM). Of great significance, intranasal immunization of VLPs induced specific immunogenic response and provided complete protection in mice challenged with the homologous influenza strain. Once the proof of concept of VLPs as an efficacious influenza vaccine was demonstrated in vivo, we developed a new inducible cell line expressing the three proteins HA, NA and the Gag fused to GFP. This was performed in an effort to streamline the production process by eliminating the transient transfection step that can be cumbersome at large scale. The process was optimized to reach a high volumetric yield of VLPs by increasing the cell density at the time of induction without sacrificing the cell specific productivity. By operating a 3L-bioreactor in perfusion mode followed by TFF, the yields of VLPs were improved by 60-fold (3x1011 Gag-GFP fluorescent events/L of culture measured by flow cytometry) compared to a standard batch culture (5x109 Gag-GFP fluorescent events/L). The process was characterized for the upstream kinetics of production of VLP proteins and recovery rates for each downstream step. The production of a single bioreactor, operated in perfusion mode, with the stable cell line 293-HA/NA/Gag-GFP yielded 5-fold more total VLP antigenic HA proteins than what was produced with the 3L-batch bioreactor using transient transfection. Our process provided unprecedented yields of influenza VLPs produced from mammalian cells. Finally, because VLPs are enveloped particles that bud from a host cell potentially enclosing host cell proteins, DNA and RNA, which could pose a safety concern, we performed a proteomic characterization of the influenza Gag-VLPs produced by transient transfection and also extracellular vesicles (EVs) produced from wild-type HEK-293 cells. The functions of all proteins identified within VLPs and EVs were critically discussed. The process developed in this thesis could support the production of VLPs harboring HA and NA of different strains for clinical trials and could potentially result in a better vaccine candidate with higher efficacy and safety to replace the current labor-intensive egg-produced influenza vaccines.