High-Yield Production Process of Influenza Virus-Like Particles in Human Cells Toward Large-Scale Vaccine Manufacturing

Le virus influenza a été la cause d'épidémies et de pandémies parmi les plus anciennes et meurtrières rapportées dans l'histoire de l'humanité. La vaccination est le moyen le plus efficace de prévenir les infections. Par contre, la fabrication actuelle des vaccins contre l'influenza se fait dans les oeufs, avec des embryons de poulet, un procédé lent et laborieux qui limite la capacité de répondre efficacement en cas de pandémie ou suite à une forte demande pour la grippe saisonnière. De plus, ces vaccins induisent principalement une réponse humorale contre les antigènes dominants hémagglutinine (HA) et neuraminidase (NA), deux protéines du virus, causant un manque de protection croisée contre certaines des nouvelles souches. Leur efficacité est également réduite chez certains groupes plus vulnérables (par ex. personnes âgées et jeunes enfants). Par conséquent, l'industrie se tourne vers le développement d'une nouvelle gamme de vaccins plus immunogéniques et produits à partir de plateformes plus efficaces. Les particules pseudo-virales (Virus-like particles en anglais, VLPs) constituent une alternative intéressante comme vaccin. Les VLPs présentent une structure qui s'apparente à celle des virus de type sauvage, en permettant la présentation à leur surface des antigènes principaux, dans leur conformation native. De plus, les particules pseudo-virales sont non-infectieuses et incapables de se répliquer. Les cellules de mammifères offrent plusieurs avantages comme plateforme d'expression pour la synthèse de nombreux produits biopharmaceutiques; elles sont capables d'effectuer des modifications post-traductionnelles complexes, de croître à haute densité et de produire des VLPs en suspension et en bioréacteur. Jusqu'à maintenant, les études traitant des VLPs influenza (produites avec des cellules de mammifères) se sont concentrées principalement sur l'assemblage du virion et sur le mécanisme de bourgeonnement cellulaire, alors que seulement un nombre limité d'études porte sur leur production à grande échelle et leur emploi potentiel comme vaccin. Dans le cadre de cette thèse, un bioprocédé transposable à grande échelle pour produire des quantités importantes de VLPs chimériques Gag-influenza à partir de cellules HEK-293 (cellules de reins issues d'un embryon humain) a été développé. En premier lieu, nous avons généré une lignée cellulaire HEK-293 exprimant de façon stable les protéines HA et NA (souche H1N1 du virus Influenza) sous le contrôle d'un système inductible au cumate. Ensuite, la formation des VLPs chimériques a été induite et dirigée par la transfection de plasmides codant la protéine Gag du virus de l'immunodéficience humaine ou la protéine M1, vii une composante de la matrice du virus de l'influenza. La protéine Gag a été fusionnée à la protéine fluorescente verte pour faciliter le suivi de la production des VLPs. Les protéines antigéniques ont été produites 7 fois plus efficacement en présence de la protéine Gag, ce qui indique qu'il s'agit d'une meilleure protéine structurale que M1 dans ce contexte. Par conséquent, la production de VLPs contenant HA-NA et Gag (par transfection) a donc été transférée à l'échelle d'un bioréacteur de 3L avec agitation. Les VLPs ont été recueillies par ultracentrifugation sur un coussin de sucrose, puis concentrées par filtration à flux tangentiel en employant une membrane ayant des pores d'une taille limite de 1000 kDa. Plusieurs techniques ont été employées pour caractériser les VLPs produites: immunodiffusion radiale simple, essai d'hémagglutination, immunobuvardage de type Western et dot blot, ainsi que la microscopie électronique à transmission. Par ailleurs, lors d'essais sur des animaux, l'immunisation intranasale à partir de VLPs a permis d'induire une réponse immunitaire spécifique en plus de conférer une protection totale à toutes les souris soumises à l'épreuve (100% d'efficacité) avec une souche homologue de l'influenza. Après avoir démontré l'efficacité des VLPs comme vaccin in vivo (démonstration de faisabilité), une nouvelle lignée cellulaire inductible a été développée, exprimant cette fois les trois protéines HA, NA et Gag fusionnée à la GFP. Le but de générer une telle lignée était de simplifier le procédé de production en éliminant l'étape de transfection transitoire, qui peut être laborieuse à conduire à grande échelle. Sans sacrifier la production spécifique, le procédé a été optimisé pour obtenir une plus grande production volumétrique en augmentant notamment la densité cellulaire au moment de l'induction et en employant un mode de perfusion. L'opération a été réalisée à l'aide d'un bioréacteur de 3L et d'une filtration à flux tangentiel subséquente permettant d'augmenter les rendements de VLPs de 60 fois (3x1011 Gag-GFP événements fluorescents/L de culture mesurés par cytométrie de flux) en comparaison à une production sans perfusion (5x109 Gag-GFP événements fluorescents/L). Le procédé a été caractérisé en déterminant la cinétique de production des protéines d'intérêts présentes dans les VLPs (le procédé en amont) ainsi que le taux de récupération pour chaque opération unitaire de la purification (le procédé en aval). L'opération du bioréacteur, en mode de perfusion et avec la lignée stable 293-HA/NA/Gag-GFP, a permis d'obtenir 5 fois plus de protéines antigéniques HA dans les VLPs que le bioréacteur opéré sans perfusion où la transfection transitoire a été employée. Le nouveau procédé développé viii a permis de générer des rendements supérieurs à ceux publiés jusqu'à ce jour pour des VLPs influenza produits à partir de cellules de mammifères. Finalement, dans le but de répondre à certaines préoccupations de biosécurité associées à un usage potentiel de VLPs comme vaccins (parce que ce sont des particules enveloppées qui bourgeonnent d'une cellule hôte et qui renferment des protéines cellulaires, de l'ADN et de l'ARN), nous avons effectué une caractérisation du protéome des VLPs Gag-influenza produites par transfection transitoire et des vésicules extracellulaires produites par des cellules HEK-293 de type sauvage. Les fonctions des protéines identifiées dans les VLPs et dans les vésicules extracellulaires ont été discutées. Le procédé développé dans le cadre de cette thèse devrait être efficace pour produire des VLPs exposant les protéines HA et NA issues de différentes souches d'influenza. Les VLPs produites pourraient être évaluées dans le cadre d'essais cliniques dans le but de conduire au développement d'un vaccin efficace et sécuritaire pour remplacer ou complémenter le procédé actuel de production dans les embryons poulets.