Identification of in Situ Progenitor Cell Features Contributing to Cartilage Repair and Strategies for Cartilage Repair Augmentation

Le cartilage articulaire hyalin recouvre l'extrémité des os longs. Sa capacité de guérison intrinsèque est faible puisqu'il n'est pas vascularisé. Suite à une blessure, la guérison n'a généralement pas lieu, ou demeure de faible amplitude. Une dégénérescence des lésions peut également survenir suite au relargage de cytokines et autres facteurs inflammatoires. Un déséquilibre entre les activités anaboliques et cataboliques peut éventuellement induire l'érosion du cartilage, l'exposition de l'os sous-jacent et l'ostéoarthrite. Les techniques de stimulation de la moelle osseuse sont une façon de stimuler la guérison du cartilage en perçant l'os situé sous les lésions du cartilage. Les canaux percés permettent aux cellules progénitrices qui se trouvent dans la moelle osseuse (bone marrow progenitor cells en anglais) de migrer vers les lésions. Ces cellules progénitrices se différencient et synthétisent un tissue de granulation qui sera remodelé en tissue de guérison. Les techniques de stimulation de la moelle osseuse sont beaucoup utilisées en clinique puisqu'elles sont simples et peu coûteuses à effectuer, que les patients se rétablissent rapidement après la chirurgie et qu'elles sont efficaces pour diminuer la douleur. Cependant, les bienfaits ressentis ne sont pas durables puisque le tissu de guérison est un tissue fibrocartilagineux qui ne possède pas les propriétés biologiques et mécaniques du cartilage hyalin. Les inconvénients les plus communs observés au cours d'études pré-cliniques et cliniques portant sur les techniques de stimulation de la moelle osseuse sont une guérison incomplète, une grande variabilité inter-individu, et des résultats insatisfaisants, surtout chez les individus plus âgés. Il a déjà été démontré dans des études pré-cliniques que l'emplacement de la lésion ainsi que l'âge de l'animal sont deux paramètres qui affectent grandement la guérison. Plus spécifiquement, chez le lapin, les lésions situées sur la trochlée guérissent mieux que les lésions situées sur le condyle fémoral médial, ce qui suggère que les cellules progénitrices de la moelle osseuse présentes aux deux emplacements ne possèderaient pas les mêmes propriétés biologiques intrinsèques. L'objectif de la première étude de cette thèse était de déterminer l'effet de l'emplacement et de l'âge de l'animal sur les propriétés biologiques intrinsèques des cellules progénitrices de la moelle osseuse. Pour ce faire, les propriétés biologiques des cellules isolées à partir de la trochlée et des condyles chez des lapins jeunes et âgés ont été caractérisées. Ensuite, puisque de précédentes études chez le lapin ont démontré qu'un perçage profond à 6 mm favorise la guérison du cartilage dans la trochlée en comparaison à un perçage peu profond, les propriétés biologiques de cellules progénitrices isolées à partir de la moelle métaphysaire (région profonde) et de la moelle épiphysaire (région peu profondes) ont été caractérisées. Deux méthodes d'isolation des cellules progénitrices ont été utilisées, soit la digestion enzymatique à la collagénase et la culture d'explants osseux. Pour chaque population de cellules progénitrices, le rendement cellulaire, le potentiel clonogénique et l'expression de différents marqueurs ont été déterminés in vitro. Le potentiel chondrogénique a, quant à lui, été déterminé en stimulant les cellules progénitrices avec un milieu de culture chondrogénique contenant de l'ascorbate, ITS et TGF-III. Enfin, le potentiel ostéogénique a été déterminé en stimulant les cellules progénitrices avec un milieu de culture ostéogénique contenant du dexamethasone, de la β-glycerophosphate et de l'ascorbate. Une comparaison entre les propriétés biologiques obtenues pour les cellules progénitrices provenant des condyles, de la trochlée profonde, ou de la trochlée peu profonde, pour les lapins jeune ou âgés et pour les cellules isolées par digestion enzymatique ou par culture d'explants a ensuite été effectuée. Selon les critères établis par l'International Society for Cell Therapy, les cellules progénitrices isolées lors de l'étude pouvaient être décrites comme une population de cellules souches mésenchymateuses. Les condyles avaient un faible rendement cellulaire en comparaison à la trochlée et les cellules progénitrices isolées à partir des condyles avaient également de faibles potentiels clonogénique et chondrogénique. En revanche, les cellules progénitrices isolées à partir de la trochlée possédaient un haut rendement cellulaire, des potentiels clonogénique et chondrogénique élevés et exprimaient beaucoup de glycosaminoglycanes et de collagène type II, deux molécules présentes dans le cartilage articulaire hyalin. Le site d'isolation ou l'emplacement était donc un facteur déterminant pour les propriétés biologiques des cellules progénitrices, ce qui suggère que le potentiel de guérison élevé observé dans la trochlée du lapin serait dû à la présence d'une population nombreuse de cellules progénitrices ayant un fort potentiel chondrogénique. L'âge des lapins s'est aussi avéré être un facteur important puisque le rendement cellulaire, l'expression de marqueurs pour cellules souches et la différenciation chondrogénique et ostéogénique étaient meilleurs chez les lapins jeunes que chez les lapins âgés. Enfin, il n'y avait pas de différence entre les cellules isolées par digestion enzymatique ou par culture d'explants. L'objectif de la deuxième étude de cette thèse était de déterminer s'il existe une corrélation entre les propriétés biologiques intrinsèques des cellules progénitrices de la moelle osseuse et la capacité de guérison du cartilage sus-jacent. Pour ce faire, un modèle bilatéral a été effectué chez 8 lapins. Pour chaque lapin, des lésions cartilagineuses ont été créées sur un genou à deux emplacements (la trochlée et le condyle fémoral médial) puis traitées par microperçage, tandis que l'autre genou demeurait intact. Après 3 semaines de guérison, les lapins ont été sacrifiés et des sections histologiques ont été récoltées du genou traité par microperçage afin d'évaluer la guérison. Parallèlement, les cellules progénitrices du genou intact ont été récoltées et leurs propriétés biologiques caractérisées tel que décrit ci-haut. Chez tous les lapins, la guérison induite par stimulation de la moelle osseuse était compromise dans le condyle fémoral médial, où très peu de tissu de guérison était présent après 3 semaines. En revanche, une guérison modérée à excellente était apparente dans la trochlée de 6 lapins sur 8, alors que 2 lapins ont été classifiés comme faisant partie d'un groupe ayant un plus faible potentiel de guérison. Tout comme pour la première étude, les cellules progénitrices de la trochlée avaient un meilleur rendement cellulaire et de forts potentiels clonogénique et chondrogénique que les cellules des condyles. Une variabilité inter-individu était également présente dans le cas des propriétés biologiques des cellules progénitrices. Les tissus de guérison de la trochlée ainsi que la matrice extracellulaire synthétisée par les cellules progénitrices isolées à partir de la trochlée contenaient une grande quantité de glycosaminoglycanes et de collagène type II. Des analyses statistiques ont permis de déterminer qu'il existait de fortes corrélations positives entre les propriétés intrinsèques des cellules progénitrices de la moelle osseuse et la capacité de guérison du cartilage sus-jacent. Les propriétés biologiques ayant le plus d'impact sur la guérison ont été identifiées. L'objectif de la troisième étude de cette thèse était de développer un modèle animal représentatif de la situation clinique, et d'y tester une nouvelle méthode de guérison. En clinique, les lésions du cartilage sont rarement détectées rapidement, ce qui complique le traitement. Une grande variabilité de la réponse et une guérison compromise sont également observées chez les patients plus âgés souffrant de lésions dégénératives chroniques. La rétraction du caillot sanguin qui remplit les lésions cartilagineuses suite au microperçage et sa perte subséquente sont une raison qui pourrait expliquer les résultats insatisfaisants observés en clinique. Il a été démontré que le chitosane permet d'inhiber la rétraction du caillot sanguin et, par le fait même, qu'il promeut la guérison du cartilage en ayant des effets sur le recrutement cellulaire, la vascularisation and le remodelage osseux. Le plasma riche en plaquettes (PRP) contient une concentration élevée de facteurs de croissance capables de stimuler le recrutement cellulaire et la différenciation chondrogénique. Il a été démontré que le chitosane favorise la stabilité du PRP et le relargage de facteurs de croissance. Un modèle de lésions cartilagineuses chroniques a d'abord été développé chez le lapin. Deux chirurgies était nécessaires pour effectuer ce modèle. Au cours de la première chirurgie, des lésions cartilagineuses bilatérales ont été induites dans la trochlée de 8 lapins et laissées sans traitement pendant 4 semaines afin qu'elles dégénèrent à un stade chronique. Au cours de la deuxième chirurgie, ces lésions cartilagineuses ont été traitées par microperçage et par l'implantation de chitosane lyophilisé solubilisé dans du PRP autologue, ou par injection de PRP seul, comme contrôle. Le tissu de guérison a été récolté après 2 mois et des sections histologiques ont permis d'évaluer la quantité et la qualité du tissu de guérison. La guérison osseuse ainsi que le remodelage osseux ont également été caractérisées par analyse micro-CT. Les implants chitosane-PRP favorisaient la guérison des lésions cartilagineuses chroniques comparées au PRP seul. La composition biochimique de la matrice cartilagineuse ressemblait plus à du cartilage hyalin en présence des implants chitosane-PRP. Finalement, l'analyse micro-CT démontrait que les implants chitosane-PRP favorisent le remodelage osseux mais que le phénomène est toujours en cours après 2 mois de guérison. En résumé, le contenu de cette thèse nous a permis d'identifier certaines variables liées à l'emplacement, au donneur et à l'âge qui expliqueraient partiellement la variabilité inter-individu et les résultats décevants parfois obtenus suite à une stimulation de la moelle osseuse. Le modèle de lésions chroniques décrit dans cette thèse contribuera grandement au développement de nouvelles techniques et de nouveaux produits pour favoriser la guérison du cartilage articulaire. Enfin, les implants chitosane-PRP étudiés au cours de cette thèse constituent une approche prometteuse qui pourrait éventuellement servir à soulager des patients souffrant de lésions chroniques ou dégénératives.