Identification of in Situ Progenitor Cell Features Contributing to Cartilage Repair and Strategies for Cartilage Repair Augmentation

Le cartilage articulaire hyalin recouvre l'extrémité des os longs. Sa capacité de guérison intrinsèque est faible puisqu'il n'est pas vascularisé. Suite à une blessure, la guérison n'a généralement pas lieu, ou demeure de faible amplitude. Une dégénérescence des lésions peut également survenir suite au relargage de cytokines et autres facteurs inflammatoires. Un déséquilibre entre les activités anaboliques et cataboliques peut éventuellement induire l'érosion du cartilage, l'exposition de l'os sous-jacent et l'ostéoarthrite. Les techniques de stimulation de la moelle osseuse sont une façon de stimuler la guérison du cartilage en perçant l'os situé sous les lésions du cartilage. Les canaux percés permettent aux cellules progénitrices qui se trouvent dans la moelle osseuse (bone marrow progenitor cells en anglais) de migrer vers les lésions. Ces cellules progénitrices se différencient et synthétisent un tissue de granulation qui sera remodelé en tissue de guérison. Les techniques de stimulation de la moelle osseuse sont beaucoup utilisées en clinique puisqu'elles sont simples et peu coûteuses à effectuer, que les patients se rétablissent rapidement après la chirurgie et qu'elles sont efficaces pour diminuer la douleur. Cependant, les bienfaits ressentis ne sont pas durables puisque le tissu de guérison est un tissue fibrocartilagineux qui ne possède pas les propriétés biologiques et mécaniques du cartilage hyalin. Les inconvénients les plus communs observés au cours d'études pré-cliniques et cliniques portant sur les techniques de stimulation de la moelle osseuse sont une guérison incomplète, une grande variabilité inter-individu, et des résultats insatisfaisants, surtout chez les individus plus âgés. Il a déjà été démontré dans des études pré-cliniques que l'emplacement de la lésion ainsi que l'âge de l'animal sont deux paramètres qui affectent grandement la guérison. Plus spécifiquement, chez le lapin, les lésions situées sur la trochlée guérissent mieux que les lésions situées sur le condyle fémoral médial, ce qui suggère que les cellules progénitrices de la moelle osseuse présentes aux deux emplacements ne possèderaient pas les mêmes propriétés biologiques intrinsèques. L'objectif de la première étude de cette thèse était de déterminer l'effet de l'emplacement et de l'âge de l'animal sur les propriétés biologiques intrinsèques des cellules progénitrices de la moelle osseuse. Pour ce faire, les propriétés biologiques des cellules isolées à partir de la trochlée et des condyles chez des lapins jeunes et âgés ont été caractérisées. Ensuite, puisque de précédentes études chez le lapin ont démontré qu'un perçage profond à 6 mm favorise la guérison du cartilage dans la trochlée en comparaison à un perçage peu profond, les propriétés biologiques de cellules progénitrices isolées à partir de la moelle métaphysaire (région profonde) et de la moelle épiphysaire (région peu profondes) ont été caractérisées. Deux méthodes d'isolation des cellules progénitrices ont été utilisées, soit la digestion enzymatique à la collagénase et la culture d'explants osseux. Pour chaque population de cellules progénitrices, le rendement cellulaire, le potentiel clonogénique et l'expression de différents marqueurs ont été déterminés in vitro. Le potentiel chondrogénique a, quant à lui, été déterminé en stimulant les cellules progénitrices avec un milieu de culture chondrogénique contenant de l'ascorbate, ITS et TGF-III. Enfin, le potentiel ostéogénique a été déterminé en stimulant les cellules progénitrices avec un milieu de culture ostéogénique contenant du dexamethasone, de la β-glycerophosphate et de l'ascorbate. Une comparaison entre les propriétés biologiques obtenues pour les cellules progénitrices provenant des condyles, de la trochlée profonde, ou de la trochlée peu profonde, pour les lapins jeune ou âgés et pour les cellules isolées par digestion enzymatique ou par culture d'explants a ensuite été effectuée. Selon les critères établis par l'International Society for Cell Therapy, les cellules progénitrices isolées lors de l'étude pouvaient être décrites comme une population de cellules souches mésenchymateuses. Les condyles avaient un faible rendement cellulaire en comparaison à la trochlée et les cellules progénitrices isolées à partir des condyles avaient également de faibles potentiels clonogénique et chondrogénique. En revanche, les cellules progénitrices isolées à partir de la trochlée possédaient un haut rendement cellulaire, des potentiels clonogénique et chondrogénique élevés et exprimaient beaucoup de glycosaminoglycanes et de collagène type II, deux molécules présentes dans le cartilage articulaire hyalin. Le site d'isolation ou l'emplacement était donc un facteur déterminant pour les propriétés biologiques des cellules progénitrices, ce qui suggère que le potentiel de guérison élevé observé dans la trochlée du lapin serait dû à la présence d'une population nombreuse de cellules progénitrices ayant un fort potentiel chondrogénique. L'âge des lapins s'est aussi avéré être un facteur important puisque le rendement cellulaire, l'expression de marqueurs pour cellules souches et la différenciation chondrogénique et ostéogénique étaient meilleurs chez les lapins jeunes que chez les lapins âgés. Enfin, il n'y avait pas de différence entre les cellules isolées par digestion enzymatique ou par culture d'explants. L'objectif de la deuxième étude de cette thèse était de déterminer s'il existe une corrélation entre les propriétés biologiques intrinsèques des cellules progénitrices de la moelle osseuse et la capacité de guérison du cartilage sus-jacent. Pour ce faire, un modèle bilatéral a été effectué chez 8 lapins. Pour chaque lapin, des lésions cartilagineuses ont été créées sur un genou à deux emplacements (la trochlée et le condyle fémoral médial) puis traitées par microperçage, tandis que l'autre genou demeurait intact. Après 3 semaines de guérison, les lapins ont été sacrifiés et des sections histologiques ont été récoltées du genou traité par microperçage afin d'évaluer la guérison. Parallèlement, les cellules progénitrices du genou intact ont été récoltées et leurs propriétés biologiques caractérisées tel que décrit ci-haut. Chez tous les lapins, la guérison induite par stimulation de la moelle osseuse était compromise dans le condyle fémoral médial, où très peu de tissu de guérison était présent après 3 semaines. En revanche, une guérison modérée à excellente était apparente dans la trochlée de 6 lapins sur 8, alors que 2 lapins ont été classifiés comme faisant partie d'un groupe ayant un plus faible potentiel de guérison. Tout comme pour la première étude, les cellules progénitrices de la trochlée avaient un meilleur rendement cellulaire et de forts potentiels clonogénique et chondrogénique que les cellules des condyles. Une variabilité inter-individu était également présente dans le cas des propriétés biologiques des cellules progénitrices. Les tissus de guérison de la trochlée ainsi que la matrice extracellulaire synthétisée par les cellules progénitrices isolées à partir de la trochlée contenaient une grande quantité de glycosaminoglycanes et de collagène type II. Des analyses statistiques ont permis de déterminer qu'il existait de fortes corrélations positives entre les propriétés intrinsèques des cellules progénitrices de la moelle osseuse et la capacité de guérison du cartilage sus-jacent. Les propriétés biologiques ayant le plus d'impact sur la guérison ont été identifiées. L'objectif de la troisième étude de cette thèse était de développer un modèle animal représentatif de la situation clinique, et d'y tester une nouvelle méthode de guérison. En clinique, les lésions du cartilage sont rarement détectées rapidement, ce qui complique le traitement. Une grande variabilité de la réponse et une guérison compromise sont également observées chez les patients plus âgés souffrant de lésions dégénératives chroniques. La rétraction du caillot sanguin qui remplit les lésions cartilagineuses suite au microperçage et sa perte subséquente sont une raison qui pourrait expliquer les résultats insatisfaisants observés en clinique. Il a été démontré que le chitosane permet d'inhiber la rétraction du caillot sanguin et, par le fait même, qu'il promeut la guérison du cartilage en ayant des effets sur le recrutement cellulaire, la vascularisation and le remodelage osseux. Le plasma riche en plaquettes (PRP) contient une concentration élevée de facteurs de croissance capables de stimuler le recrutement cellulaire et la différenciation chondrogénique. Il a été démontré que le chitosane favorise la stabilité du PRP et le relargage de facteurs de croissance. Un modèle de lésions cartilagineuses chroniques a d'abord été développé chez le lapin. Deux chirurgies était nécessaires pour effectuer ce modèle. Au cours de la première chirurgie, des lésions cartilagineuses bilatérales ont été induites dans la trochlée de 8 lapins et laissées sans traitement pendant 4 semaines afin qu'elles dégénèrent à un stade chronique. Au cours de la deuxième chirurgie, ces lésions cartilagineuses ont été traitées par microperçage et par l'implantation de chitosane lyophilisé solubilisé dans du PRP autologue, ou par injection de PRP seul, comme contrôle. Le tissu de guérison a été récolté après 2 mois et des sections histologiques ont permis d'évaluer la quantité et la qualité du tissu de guérison. La guérison osseuse ainsi que le remodelage osseux ont également été caractérisées par analyse micro-CT. Les implants chitosane-PRP favorisaient la guérison des lésions cartilagineuses chroniques comparées au PRP seul. La composition biochimique de la matrice cartilagineuse ressemblait plus à du cartilage hyalin en présence des implants chitosane-PRP. Finalement, l'analyse micro-CT démontrait que les implants chitosane-PRP favorisent le remodelage osseux mais que le phénomène est toujours en cours après 2 mois de guérison. En résumé, le contenu de cette thèse nous a permis d'identifier certaines variables liées à l'emplacement, au donneur et à l'âge qui expliqueraient partiellement la variabilité inter-individu et les résultats décevants parfois obtenus suite à une stimulation de la moelle osseuse. Le modèle de lésions chroniques décrit dans cette thèse contribuera grandement au développement de nouvelles techniques et de nouveaux produits pour favoriser la guérison du cartilage articulaire. Enfin, les implants chitosane-PRP étudiés au cours de cette thèse constituent une approche prometteuse qui pourrait éventuellement servir à soulager des patients souffrant de lésions chroniques ou dégénératives.

Abstract

Articular cartilage is a thin layer of hyaline cartilaginous tissue covering the ends of long bones. Due to its avascular nature, it possesses very limited regeneration potential. In the event of an injury, the repair is either very limited or not initiated at all. As a result, cartilage lesions degenerate extensively under the influence of damaging cytokines and proinflammatory factors released. An imbalance in anabolic and catabolic activities continues to erode the cartilaginous surface exposing subchondral bone leading to osteoarthritis. Bone marrow stimulation (BMS) initiates repair by fracturing or drilling into subchondral bone. The channels created provide access to the underlying subchondral progenitor cells that are recruited into the defect. Granulation tissue thus formed undergoes a complex cascade of events to generate a repair tissue. BMS is considered a gold standard of cartilage repair strategies since it is easy, relatively less invasive with swift recovery, more economical and appreciable short-mid term relief. However, long term outcome is generally discouraging due to poor durability of repair tissue. The quality of repair tissue is generally fibrocartilagenous with inferior mechanical and biological characteristics compared to hyaline cartilage. The most common drawbacks of the procedure include incomplete regeneration, high inter-individual variability and poor repair outcome especially in older individuals in preclinical as well as clinical studies. Earlier studies have shown that defect location and animal age affect the cartilage repair outcome observed in vivo, suggesting a strong influence of biological characteristics of progenitor cells (Bone Marrow stem cells; BMSCs or mesenchymal stem cells; MSCs) present in subchondral bone. Specifically, rabbit trochlea showed a superior repair and chondrogenic potential compared to the medial femoral condyle. Inspired by these observations, we carried out a study for comprehensive analysis of progenitor cells present in the subchondral bone of condyle and trochlea in young and old rabbits in order to determine the influence of location and age on the properties of progenitor cells. Earlier we had found that drilling to 6 mm improves the repair outcome in rabbit trochlea possibly by providing access to metaphyseal marrow and thus higher progenitor cell population. As a result, MSCs were isolated from epiphyseal (trochlea upper) and metaphyseal (trochlea lower) regions of the trochlea. Collagenase-derived MSCs originated from collagenase digest of bone chips while the digested explants were subsequently cultured to obtain explant-derived MSCs via cell outgrowth. In vitro characterization assays were used to determine the cell yield, clonogenic potential and surface marker expression profile. Chondrogenic differentiation was stimulated using pellets of condylar and trochlear MSCs in the presence of chondrogenic media, rich in chondrogenic stimulating factors such as ascorbate, insulin-transferrin-selenium (ITS) and TGF-βIII. Finally, MSCs were differentiated into osteogenic lineage in presence of osteogenic media containing osteogenic stimulants such as dexamethasone, β-glycerophosphate and ascorbate. The aforementioned MSC characteristics were compared for trochlea vs. condyle, old vs. young and collagenase- vs. explant-derived cultures. MSCs isolated from distal femur epiphyseal bone had stem cell characteristics and fulfilled the stem cell criteria outlined by International Society for Cell Therapy. Location was an important factor influencing the properties of MSCs indicated by low cell yield, clonogenic potential and inferior chondrogenic potential of condylar cells. Results showed that rabbit trochlear vs. condylar subchondral bone yielded a greater number of progenitors with superior cartilaginous matrix expression under chondrogenic conditions suggesting higher intrinsic capacity for cartilage repair compared to condylar subchondral bone. Trochlear MSCs displayed superior chondrogenic differentiation evidenced by higher glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II deposition. Age of the donor was an additional factor with significant bearing on the inherent properties of MSCs since growth rate, cell yield, expression of stem cell markers and osteogenic differentiation were found to be significantly superior in younger animals. As expected, no significant difference was observed between collagenase- and explant-derived cultures. Continuing our exploration of the mechanisms underlying variability in BMS procedure, we carried out the next study to verify if the cartilage repair outcome in condyle and trochlea correlated with the pre-existing properties of progenitor cells present in these two sites. A bilateral rabbit model was used to test this hypothesis. For each rabbit, full thickness acute defects were created in one knee and treated by BMS by microdrilling, while the second knee was left intact. Animals were sacrificed 3 weeks later and transverse sections of repair tissue from the treated knee were used to analyze the quality and quantity of repair macroscopically and by safranin- O (Saf-O) and immunostaining. At the time of animal sacrifice, distal femurs were separated and MSCs were isolated from condylar and trochlear regions of the intact contralateral knee for biological characterization of cell yield, clonogenic potential, cell surface marker profile and differentiation potency. BMS induced inferior cartilage repair in condyles of all donors studied further underlining the implication of location in influencing repair outcome. Macroscopic examination revealed extremely poor fill in condylar defects. In contrast, moderate to excellent fill was observed in six out of eight trochlear defects. This led us to identify a donor-dependent variability in repair outcome and the donors were classified as good trochlear responders and poor trochlear responders. In another observation, trochlear MSCs were characterized by increased cell yield, higher clonogenic potential and superior chondrogenic potential. Histopathological analysis indicated better matrix composition, rich in GAG and collagen type II in trochlea both in vivo and in vitro. Donor related variability in repair outcome was also observed in vitro through biological characterization of MSCs. Statistical analysis provided substantial evidence to identify strong, positive location- and donor-dependent correlations between inherent properties of MSCs and cartilage repair outcome in condyle and trochlea and factors with maximum influence on the repair outcome were identified. By this stage, it became imperative to seek after a clinically relevant application of our understanding based on current and past findings. Cartilage lesions are rarely detected in early stages, unfortunately reducing the efficacy of BMS procedure. Unpredictable, highly variable repair of poor quality is observed in degenerative defects, especially in older patients. Platelet-mediated retraction of the blood clot that fills cartilage lesions following BMS is believed to be one underlying cause of inferior quality and durability of repair tissue. Chitosan inhibits this blood clot shrinkage and leads to the formation of a voluminous, adherent and stable clot and thereby enhances cartilage repair by promoting cell recruitment, transient vascularization and subchondral bone remodeling. Platelet-rich-plasma (PRP) contains a 2-10 fold concentration of growth factors and cytokines and has been shown to improve recruitment and chondrogenic potential of subchondral MSCs. Chitosan increases the stability of PRP and promotes the release of platelet-derived growth factors in a more sustained manner. Using a more clinically relevant chronic defect model, we tested the efficacy of implants composed of freeze-dried chitosan solubilized in PRP in improving marrow stimulated cartilage repair outcome compared to BMS augmented with just PRP. Two surgeries were performed in skeletally mature rabbits to create a bilateral trochlear defect model. Defects created in the first surgery were allowed to degenerate over 4 weeks and repaired in a second surgery by BMS. Treatments included BMS augmented with chitosan/PRP implants in one knee and BMS with PRP in the other knee. Repair tissue was harvested 2 months later and transverse sections were used to characterize the quality and quantity of repair by assessing the GAG and coll-II deposition. Subchondral bone repair was analysed by micro-CT. Augmentation of BMS with freeze-dried chitosan/PRP implants in chronic defects improved cartilage repair compared to PRP by increasing quantity and quality of repair tissue and promoting subchondral bone repair. Matrix composition was improved in presence of chitosan/PRP indicated by increased GAG and collagen deposition. MicroCT analysis showed further evidence of increased, albeit incomplete, subchondral bone remodeling induced by chitosan/PRP. In summary, these studies led us to recognize significant donor-, age- and location-dependent variability which might help in understanding the mechanism underneath the unpredictability and inter-individual variability observed with BMS. Needless to say, these observations would be extremely valuable in improving the consistency, durability and quality of BMS repair procedure. Moreover, the innovative chronic model studied here is expected to make significant contributions in progress of cartilage repair field. Finally, chitosan/PRP implants investigated in this research are a promising approach to treat chronic cartilage lesions and could eventually provide relief to osteoarthritic patients with challenging, degenerative defects.