Production de peptides synthétiques et mise au point d'échafaudages moléculaires pour le génie tissulaire

Le développement de structures biomimétiques, notamment les hydrogels, a révolutionné le domaine des biomatériaux durant les dernières décennies. Les hydrogels ont été utilisé dans diverses applications comme la livraison de biomolécules thérapeutiques et de cellules mais aussi pour jouer le rôle de support de soutien pour la régénération d'un tissu endommagé. Plusieurs études ont démontré que l'utilisation des peptides synthétiques, tels que les peptides présentant le motif "coiled-coil", pour la réticulation des chaines polymériques, présente plusieurs avantages et plus particulièrement l'anticipation de la structure à partir de leur séquence primaire. En voulant se pencher sur la conception et le développement de structures tridimensionnelles à base des peptides Kcoil et Ecoil, peptides synthétiques fortement utilisés dans notre groupe de recherche, nous devions en premier lieu trouver une alternative à la synthèse chimique pour la production de ces peptides à moindre coût. Une première étude portant sur le développement d'un procédé adéquat pour la production biologique de Kcoil a été réalisée en utilisant Escherichia coli. La fusion à plusieurs protéines (p.e. MBP, TRX, NusA, GST, KSI) a été testée et le meilleur niveau d'expression avait été enregistré avec la thiorédoxine (TRX). Le procédé de production et de purification développé a permis de récupérer 1.5 mg par litre de Kcoil pur. L'identité de la séquence peptidique et son affinité à son partenaire Ecoil ont été vérifiées par spectroscopie de masse et par un test basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR), respectivement. Ces travaux de recherche ont été présentés lors de la conférence internationale "Protein Engineering Summit : PEGS Boston" en mai 2014 et ont été publiés dans le journal "Amino Acids" sous le titre "Soluble expression, purification and functional characterization of a coil peptide composed of a positively charged and hydrophobic motif". La deuxième étude présentée dans ce manuscrit porte sur la conception et le développement d'hydrogels à base de dextrane. À cause de plusieurs problèmes d'ordre technique, l'utilisation de l'hétérodimère Kcoil/Ecoil a été remplacée par le trisodium trimétaphosphate (STMP) pour la réticulation du dextrane en un réseau tridimensionnel. Un ratio de Wdextrane :WSTMP de 3:1 a permis d'avoir un hydrogel transparent, stable, présentant une surface lisse et facilement manipulable. Étant donné que le dextrane a des propriétés anti-adhésives, le greffage du motif peptidique RGD était nécessaire pour la culture des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Une quantité minimale de RGD sur les chaines du dextrane (c.-à-d. 0.1% du total en polymère) a abouti à la formation d'un tissu cellulaire confluent après 3h d'inoculation. L'ajout du chlorure de sodium (WPolymère :WNaCl=1 :0.25) au mélange original et à la surface du gel a généré une structure poreuse favorisant l'échange métabolique et la migration cellulaire. L'analyse par microscopie de la culture des cellules "HUVEC" sur les gels poreux avait montré que ces dernières adhèrent rapidement, prolifèrent et migrent à l'intérieur de la matrice après une culture de 7 jours. Les résultats relatifs à ces travaux de recherche ont été résumés dans un article scientifique intitulé "Development of RGD functionalized dextran based hydrogels for cell delivery" et qui a été soumis pour publication dans le journal "Carbohydrate Polymers". Une dernière étude a été réalisée sur l'identification de la méthode optimale pour la co-immobilisation d'un facteur de croissance et des résidus RGD sur les chaines de dextrane. La protéine doublement étiquetée en N-terminal Cys-Ecoil-EGF a été conçue au départ pour participer à la fois à la réticulation des chaines de dextrane et à l'immobilisation du facteur de croissance épidermique (EGF) dans le gel obtenu. La protéine était aussi active en solution que son contrôle (Ecoil-EGF). Cependant, le recrutement du récepteur de EGF était fortement influencé par la méthode de greffage (c.-à-d. via interaction Kcoil/Ecoil ou par couplage de thiols) de la protéine Cys-Ecoil-EGF sur la surface de la puce de SPR. Un essai cellulaire in vitro a été réalisé pour vérifier les résultats obtenus par SPR. Les cellules vasculaires musculaires lisses (VSMC) de rat ont été cultivées en présence de Cys-Ecoil-EGF immobilisé par couplage de thiols ou par interactions "coiled-coil" sur un revêtement de chondroitine sulfate. L'analyse de la densité de protéines immobilisées dans les deux cas de figure en utilisant une méthode d'analyse immuno-enzymatique (ELISA) a confirmé que l'immobilisation des protéines par interaction Kcoil/Ecoil est plus efficace pour préserver l'activité biologique de la protéine, ce qui est en accord avec le test de survie des VSMC. Les travaux présentés ici ont été résumés dans un manuscrit dont le titre est "Bioavailability of immobilized Epidermal Growth Factor : Covalent versus Non-Covalent Grafting" et qui a été soumis pour publication dans le journal "Biointerphases".