Production de peptides synthétiques et mise au point d'échafaudages moléculaires pour le génie tissulaire

Le développement de structures biomimétiques, notamment les hydrogels, a révolutionné le domaine des biomatériaux durant les dernières décennies. Les hydrogels ont été utilisé dans diverses applications comme la livraison de biomolécules thérapeutiques et de cellules mais aussi pour jouer le rôle de support de soutien pour la régénération d'un tissu endommagé. Plusieurs études ont démontré que l'utilisation des peptides synthétiques, tels que les peptides présentant le motif "coiled-coil", pour la réticulation des chaines polymériques, présente plusieurs avantages et plus particulièrement l'anticipation de la structure à partir de leur séquence primaire. En voulant se pencher sur la conception et le développement de structures tridimensionnelles à base des peptides Kcoil et Ecoil, peptides synthétiques fortement utilisés dans notre groupe de recherche, nous devions en premier lieu trouver une alternative à la synthèse chimique pour la production de ces peptides à moindre coût. Une première étude portant sur le développement d'un procédé adéquat pour la production biologique de Kcoil a été réalisée en utilisant Escherichia coli. La fusion à plusieurs protéines (p.e. MBP, TRX, NusA, GST, KSI) a été testée et le meilleur niveau d'expression avait été enregistré avec la thiorédoxine (TRX). Le procédé de production et de purification développé a permis de récupérer 1.5 mg par litre de Kcoil pur. L'identité de la séquence peptidique et son affinité à son partenaire Ecoil ont été vérifiées par spectroscopie de masse et par un test basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR), respectivement. Ces travaux de recherche ont été présentés lors de la conférence internationale "Protein Engineering Summit : PEGS Boston" en mai 2014 et ont été publiés dans le journal "Amino Acids" sous le titre "Soluble expression, purification and functional characterization of a coil peptide composed of a positively charged and hydrophobic motif". La deuxième étude présentée dans ce manuscrit porte sur la conception et le développement d'hydrogels à base de dextrane. À cause de plusieurs problèmes d'ordre technique, l'utilisation de l'hétérodimère Kcoil/Ecoil a été remplacée par le trisodium trimétaphosphate (STMP) pour la réticulation du dextrane en un réseau tridimensionnel. Un ratio de Wdextrane :WSTMP de 3:1 a permis d'avoir un hydrogel transparent, stable, présentant une surface lisse et facilement manipulable. Étant donné que le dextrane a des propriétés anti-adhésives, le greffage du motif peptidique RGD était nécessaire pour la culture des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Une quantité minimale de RGD sur les chaines du dextrane (c.-à-d. 0.1% du total en polymère) a abouti à la formation d'un tissu cellulaire confluent après 3h d'inoculation. L'ajout du chlorure de sodium (WPolymère :WNaCl=1 :0.25) au mélange original et à la surface du gel a généré une structure poreuse favorisant l'échange métabolique et la migration cellulaire. L'analyse par microscopie de la culture des cellules "HUVEC" sur les gels poreux avait montré que ces dernières adhèrent rapidement, prolifèrent et migrent à l'intérieur de la matrice après une culture de 7 jours. Les résultats relatifs à ces travaux de recherche ont été résumés dans un article scientifique intitulé "Development of RGD functionalized dextran based hydrogels for cell delivery" et qui a été soumis pour publication dans le journal "Carbohydrate Polymers". Une dernière étude a été réalisée sur l'identification de la méthode optimale pour la co-immobilisation d'un facteur de croissance et des résidus RGD sur les chaines de dextrane. La protéine doublement étiquetée en N-terminal Cys-Ecoil-EGF a été conçue au départ pour participer à la fois à la réticulation des chaines de dextrane et à l'immobilisation du facteur de croissance épidermique (EGF) dans le gel obtenu. La protéine était aussi active en solution que son contrôle (Ecoil-EGF). Cependant, le recrutement du récepteur de EGF était fortement influencé par la méthode de greffage (c.-à-d. via interaction Kcoil/Ecoil ou par couplage de thiols) de la protéine Cys-Ecoil-EGF sur la surface de la puce de SPR. Un essai cellulaire in vitro a été réalisé pour vérifier les résultats obtenus par SPR. Les cellules vasculaires musculaires lisses (VSMC) de rat ont été cultivées en présence de Cys-Ecoil-EGF immobilisé par couplage de thiols ou par interactions "coiled-coil" sur un revêtement de chondroitine sulfate. L'analyse de la densité de protéines immobilisées dans les deux cas de figure en utilisant une méthode d'analyse immuno-enzymatique (ELISA) a confirmé que l'immobilisation des protéines par interaction Kcoil/Ecoil est plus efficace pour préserver l'activité biologique de la protéine, ce qui est en accord avec le test de survie des VSMC. Les travaux présentés ici ont été résumés dans un manuscrit dont le titre est "Bioavailability of immobilized Epidermal Growth Factor : Covalent versus Non-Covalent Grafting" et qui a été soumis pour publication dans le journal "Biointerphases".

Abstract

The development of biomimetic structures, especially hydrogels, has revolutionized the field of biomaterials in the recent decades. Hydrogels have been used in various applications such as delivery of therapeutic biomolecules and cells but also as a support for damaged tissue regeneration. Several studies have demonstrated that the use of de novo designed peptides, such as those presenting "coiled-coil" motif, for the crosslinking of polymers presents several advantages and more particularly the structure anticipation from their primary sequence. In order to study the design and development of three-dimensional structures based on the peptides Kcoil and Ecoil, synthetic peptides highly used in our research group, we first had to find an alternative to chemical synthesis for the lower cost production of these peptides. A first study on the development of a suitable process for Kcoil biological production was carried out using Escherichia coli. Several fusion proteins (e.g. MBP, TRX, NusA, GST, KSI) were tested and the best expression level was noted with thioredoxin (TRX). The process of production and purification developed made it possible to recover 1.5 mg of pure Kcoil per liter of bacterial culture. The identity of the peptide sequence and its affinity to its Ecoil partner were verified by mass spectroscopy and surface plasmon resonance (SPR) based assay, respectively. This research was presented at the international conference "Protein Engineering Summit: PEGS Boston" in May 2014 and published in the journal "Amino Acids" in a scientific paper entitled "Soluble expression, purification and functional characterization of a coil peptide composed of a positively charged and hydrophobic motif ". The second study presented in this manuscript concerns the design and development of dextran-based hydrogel. Due to several technical problems, the use of the Kcoil/Ecoil heterodimer has been replaced by trisodium trimetaphosphate (STMP) for the cross-linking of dextran in a three-dimensional network. A ratio Wdextran:WSTMP of 3:1 allow us to get a transparent and stable hydrogel, presenting a smooth surface and was easily to handle. Adhesive peptide motif (RGD) grafting, was required for the culture of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) because of the anti-adhesive dextran properties. A minimal amount of RGD on the dextran chains (ie, 0.1% of the total of polymer) resulted in the formation of a confluent cellular tissue after 3 h of inoculation. The addition of sodium chloride (WPolymer: WNaCl = 1: 0.25) to the original mixture and to the surface of the gel, generated a macroporous structure which promotes metabolic exchange and cell migration. Microscopic analysis showed that HUVEC cells adhere rapidly, proliferate and migrate within the matrix after a 7-day culture. The results of this research were summarized in a scientific article entitled "Development of RGD functionalized dextran based hydrogels for cell delivery" which was submitted for publication in the journal "Carbohydrate Polymers". A final study was carried out on the identification of the optimal method for the co-immobilization of a growth factor with RGD residues on dextran chains. The double tagged Cys-Ecoil-EGF protein was originally designed to participate in both the crosslinking of dextran chains and the immobilization of epidermal growth factor (EGF) in the resulting hydrogel. The protein was active in solution as much as its control (Ecoil-EGF), however recruitment of the EGF receptor was strongly influenced by the grafting method (i.e. via Kcoil/Ecoil interaction or by thiol coupling strategy) of Cys-Ecoil-EGF protein on the surface of SPR chip. An in vitro cell assay was performed to verify the results obtained by SPR. Smooth muscle vascular cells (VSMC) of rat culture was performed in the presence of immobilized Cys-Ecoil-EGF protein by thiol coupling or by coiled-coil interactions on a chondroitin sulfate coating. Analysis of the density of immobilized proteins in both cases using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method confirmed that protein immobilization by Kcoil/Ecoil interaction is more efficient in preserving protein biological activity, which agrees with the survival test of VSMC. The work presented here was summarized in a manuscript entitled "Bioavailability of immobilized Epidermal Growth Factor: Covalent versus Non-Covalent Grafting" which was submitted for publication in the journal "Biointerphases".