Identification des propriétés structurales du chitosane induisant la libération de cytokines pro-régénératrices chez les macrophages humains

Le cartilage articulaire possède une faible capacité de réparation intrinsèque car celui-ci est avasculaire. Initiée par un traumatisme ou une inflammation chronique de l'articulation, l'arthrose est une pathologie des articulations caractérisée par une dégradation du cartilage articulaire et de l'os sous-jacent. La stimulation osseuse est la procédure chirurgicale la plus recommandée pour traiter les lésions ostéochondrales. Cette procédure consiste à induire une réponse de guérison spontanée dans l'os sous-chondral afin d'induire le recrutement de MSC dans la lésion ostéochondrale et la génération d'un nouveau tissu cartilagineux. Présentement, il existe un besoin clinique de développer des traitements auxiliaires à la stimulation osseuse qui permettront d'augmenter le recrutement de MSC in situ et leur différenciation dans le nouveau tissu de réparation. Le chitosane est un polysaccharide composé d'unité de glucosamine et N-acétyl-glucosamine qui a été utilisé précédemment pour améliorer l'attraction des MSC et la réparation du cartilage induite par stimulation osseuse. Une étude de ces mécanismes cellulaires derrière cette meilleure réparation du cartilage a démontré que les macrophages pourraient jouer des rôles vitaux dans la meilleure réparation du tissu. Il est reconnu que les macrophages présents dans le tissu de granulation et la membrane synoviale sécrètent une vaste gamme de molécules solubles qui peuvent promouvoir le succès, ou l'échec de la réparation du cartilage. Par conséquent, les approches thérapeutiques visant à moduler le phénotype des macrophages afin que celles-ci sécrètent des cytokines anti-inflammatoires et anaboliques qui favorisent le recrutement des MSC s'avèrent prometteuses. Pour ces raisons, le chitosane est très intéressant, car celui-ci possède un potentiel immunomodulatoire important sur les cellules de l'immunité innée. Toutefois, ces propriétés immunomodulatrices sur les macrophages demeurent méconnues. Un obstacle majeur est de comprendre quelles sont les propriétés structurales du chitosane qui mènent aux réponses pro- ou anti-inflammatoires chez les macrophages. Cette thèse de doctorat vise à caractériser les interactions entre les macrophages et le chitosane afin de déterminer comment ce polysaccharide peut être utilisé pour moduler le comportement des macrophages afin d'améliorer la réparation du cartilage et maintenir l'intégrité des articulations. Les objectifs principaux de cette thèse sont de : 1) Déterminer comment le comportement des macrophages peut être modulé par le chitosane afin de stimuler chez ces cellules la libération de facteurs anti-inflammatoire et anabolique capables d'améliorer la réparation du cartilage et protéger son intégrité. 2) Générer une librairie de chitosanes possédant des propriétés structurales distinctes afin d'évaluer l'influence de ces propriétés sur la capacité des macrophages à sécréter des facteurs bénéfiques pour la réparation du cartilage. 3) Identifier les mécanismes cellulaires et les motifs structuraux du chitosane permettant à ce polysaccharide d'induire chez les macrophages des réponses anti-inflammatoires tout en minimisant l'activation de réponses pro-inflammatoire.

Dans le premier article présenté dans cette thèse, nous avons testé l'hypothèse que le chitosane biodégradable (degré de déacetylation (DDA) 80%, poids moléculaire moyen de nombre (Mn) 132 kDa) stimule les macrophages sous différents états de polarisation à sécréter des facteurs anti-inflammatoires et des molécules chimiotactiques pour les MSC. Pour cette étude, des macrophages humains U937 ont été obtenus par différenciation avec du phorbol myristate acétate (PMA) et ont été polarisées en macrophages M1 ou M2a par le biais d'une stimulation IFN-γ/LPS ou IL-4 (en présence ou absence de particules de chitosanes). Nous avons observé que la stimulation au chitosane induit la libération de cytokines bien distinctes en fonction du phénotype macrophagique de départ. Chez les macrophages M0 et M2a, le chitosane a stimulé la libération de chimiokines (CCL2/MCP-1, CXCL10/IP-10 et CCL4/MIP-1β), de cytokines anti-inflammatoires (IL-1ra et IL-10) et d'IL-1β, avec 25 à 400 fois plus d'IL-1ra que d'IL-1β. Chez les macrophages M1, le chitosane a amplifié la libération d'IL-1β sans augmenter la production d'IL-1ra. En utilisant des essais de migration in vitro, nous avons observé que les milieux conditionnés de macrophages M0 et M2a stimulent la migration des MSC tandis que les milieux conditionnés provenant des macrophages M1 sont incapables de le faire. Ensuite, nous avons testé l'hypothèse que le chitosane acétylé induit la phosphorylation des protéines STAT-1 et STAT-6 afin de conduire à la libération des facteurs CXCL10/IP-10 et IL-1ra. Nous avons observé que le chitosane stimule la libération d'IL-1ra de manière indépendante à la protéine STAT-6 tandis qu'il stimule la libération de CXCL10/IP-10 par le biais de la voie STAT-1. Cette activation, qui est différée, n'est pas observée lors que les macrophages sont stimulés avec un chitosane non biodégradable (98% DDA, Mn 128 kDa). Chez des macrophages primaires humains, l'augmentation de la production d'IL-1β et CXCL10/IP-10 par la stimulation au chitosane (80% DDA, Mn 132 kDa) était uniquement observée lorsque ces cellules étaient préalablement activées avec le PMA. En absence de PMA, la stimulation au chitosane a uniquement stimulé la production d'IL-1ra, suggérant ainsi que le chitosane stimule IL-1ra de manière indépendante à IL-1β. En adressant le premier objectif de cette thèse, nous avons démontré que le chitosane biodégradable n'altère pas la capacité intrinsèque des macrophages à attirer des MSC. Nos travaux ont identifié que le chitosane peut être utilisé pour guider les macrophages dans l'articulation à libérer de manière endogène des chimiokines et les facteurs IL-1ra et IL-10 en excès par rapport au facteur IL-1β. Dans le deuxième article, nous identifions davantage les mécanismes moléculaires et les motifs structuraux minimaux du chitosane permettant à ce polysaccharide d'augmenter la production simultanée de soit IL-1ra et IP-10, ou bien IL-1β et PGE2. Nous avons généré une libraire unique de 20 chitosanes possédant des DDA (60, 80 et 98%), patron d'acétylation (en bloc et aléatoire) et Mn (1, 3, 5, 10 et > 100 kDa) distincts et nous avons évalué leur capacité à stimuler la libération d'IP-10, IL-1ra, IL-1β et PGE2 chez des macrophages U937. Nous rapportons qu'une gamme spécifique de chitosanes (98% DDA, 3-10 kDa; 80% DDA, acétylation en bloc, 10 et 190 kDa) induis à de faibles doses une réponse IFN de type 1, qui comprend une activation paracrine de STAT-1/STAT-2 par l'IFN-β et qui mène ultimement à la libération simultanée d'IL-1ra et IP-10. À de plus fortes doses, les chitosanes de 98% de DDA dont le Mn est supérieur à 5 kDa ont stimulé l'activation de l'inflammasome. Cette activation a mené à la costimulation d'IL-1β et PGE2 qui est responsable de l'inhibition de la réponse IFN de type 1. Nous démontrons que la capacité de certaines chitosanes à induire la libération de cytokines dépend en autre de leur capacité intrinsèque à briser les lysosomes une fois internalisés dans les macrophages. La nature et l'ampleur des cytokines sécrétées dépend en autre de la sévérité de la rupture lysosomale. Pour résumer, cette thèse suggère que certains chitosanes peuvent être utilisés pour intensifier la libération endogène des facteurs IL-1ra et IL-10 à partir des macrophages activés, afin de protéger l'articulation des cytokines cataboliques comme l'IL-1β. La librairie de chitosanes générée dans cette thèse contribue à déterminer les motifs structuraux du chitosane menant à la libération de cytokines pro- et anti-inflammatoires par les macrophages et amène de nouvelles connaissances sur les propriétés immunomodulatrices du chitosane. Ces connaissances permettront d'utiliser ce biomatériau polysaccharidique de manière plus efficace et sécuritaire pour la réparation du cartilage articulaire et pour un vaste nombre d'applications biomédicales.

Abstract

Articular cartilage has very limited intrinsic repair abilities due to its avascular nature. Hence, trauma or chronic knee joint inflammation often lead to osteochondral lesions that further degenerate and promote development of osteoarthritis, a pathological condition caracterized by degradation of the articular cartilage and its underlying subchondral bone. To date, marrow-stimulation procedures are the first-line treatment options available for patients with osteochondral lesions. This procedure involves creating a spontaneous wound repair response in the subchondral bone tissue in order to recruit mesenchymal stem cells (MSC) to the lesion site in order to generate a new cartilage tissue. There is a current need for augmented-marrow stimulation procedures which involve the use of biomaterials in order to augment the in situ recruitment of MSC and support proper anatomical differentiation of these cells. Chitosan is a polysaccharide biomaterial composed of glucosamine and N-acetyl glucosamine monomers that has previously been shown to improve marrow-stimulation elicited MSC attraction and cartilage repair. The mechanisms behind the improved cartilage-repair response are partly elucidated and have suggested macrophages to be principal orchestrators of the improved repair response. It is now recognized that macrophages within the granulation tissue and the synovial membrane secrete a wide spectrum of soluble mediators that influence for better or worse the outcome of the cartilage repair procedures. Hence, strategies that modulate macrophage phenotype in order to guide these cells to release anti-inflammatory cytokines and anabolic factors that promote MSC attraction are promising alternatives for cartilage repair. In this regard, chitosan has attracted great interest because of its immunomodulatory potential in innate immune cells. Yet, its immune modulating properties in macrophages are controversial, as studies have both reported pro- or anti-inflammatory effects of chitosan in macrophages. More importantly, the minimal structural motifs required for chitosan to induce these divergent pro- or anti-inflammatory responses in macrophages remain unidentified. This thesis aims at caracterizing the interactions between macrophages and chitosan in order to determine how this polysaccharide can be used to modulate macrophage behavior in order to improve cartilage repair and preserve knee joints. The main objective of this thesis are to: 1) Determine how macrophage behavior can be modulated by chitosan stimulation in order to guide the release of anti-inflammatory and anabolic mediators that can improve cartilage repair and maintain knee joint integrity. 2) Generate a library of chitosans with distinct structural properties in order to evaluate the influence of chitosan structural properties on the macrophage ability to secrete factors that are beneficial for cartilage repair. 3) Define the cellular mechanisms that are involved in chitosan-mediated macrophage activation and identify the minimal structural motifs that allows chitosan to drive the release of anti-inflammatory cytokines while minimizing the release of pro-inflammatory factors.

To fulfill the first objective of this thesis, we tested the hypothesis that chitosan (80% degree of deacetylation (DDA), number-average molecular weight (Mn) 132 kDa) stimulates macrophages under different polarization states to release functional MSC chemokines and anti-inflammatory factors. In this study, U937 macrophages were obtained through phorbol-ester differentiation and further polarized to M1 or M2a phenotypes using IFN-γ/LPS or IL-4 stimulation in presence or absence of chitosan microparticles. We found that chitosan stimulation lead to distinct cytokine responses that depended on macrophage polarisation state. In M0 and M2a macrophages, chitosan enhanced the release of chemokines (CCL2/MCP-1, CXCL10/IP-10, CCL4/MIP-1β), anti-inflammatory cytokines (IL-1ra and IL-10), and IL-1β, with a 25- to 400-fold excess release of IL-1ra over IL-1β. In M1 macrophages, chitosan amplified IL-1β release and failed to enhance IL-1ra production. Using MSC chemotaxis assay, we found that conditioned medium from M0 and M2a macrophages, with or without chitosan stimulation, attracted primary human MSCs whereas M1 macrophage conditioned medium failed to stimulate MSC migration. We then tested the hypothesis that acetylated chitosan induces the release of CXCL10/IP-10 and IL-1ra through the phosphorylation of the proteins STAT-1 and STAT-6 respectively. We found that chitosan stimulates IL-1ra release independently of STAT-6 activation whereas it induced CXCL10/IP-10 through a delayed activation of STAT-1. This delayed STAT-1/IP-10 response was not observed when macrophages were stimulated with non biodegradable chitosan (98% DDA, Mn 128 kDa). In primary human macrophages, chitosan (80% DDA, 132 kDa) stimulated CXCL10/IP-10 and IL-1β release only when cells were primed with PMA. In absence of PMA, chitosan stimulation only increased IL-1ra released, suggesting that IL-1ra induction in primary cells was independent of IL-1β release. These data fulfilled the first objective of this thesis, by allowing us to conlude that biodegradable chitosan particles do not alter the inherent capacity of macrophages to attract MSC. Instead, we concluded that chitosan can be used to guide macrophages to repairing bone marrow stimulation defects, and to induce macrophages to release excess amounts of IL-1ra and IL-10 over IL-1β, and chemokines. In the second article presented in this thesis, we further identify the molecular mechanisms and minimal chitosan structural motifs required for chitosan that lead to the co-stimulation of either IL-1ra and CXCL10/IP-10, or IL-1β and PGE2. We generated a unique library of 20 chitosans with distinct DDA (60, 80 and 98%), acetylation pattern (block and random) and Mn (1, 3, 5, 10 and > 100 kDa) and evaluated their ability to stimulate CXCL10/IP-10, IL-1ra, IL-1β and PGE2 release in U937 macrophages. We found that a type 1 IFN response was elicited by specific chitosans (98% DDA, 3-10 kDa; block-acetylated 80% DDA, 10 and 190 kDa) at low doses which lead to paracrine IFN-β activity leading to STAT-1/STAT-2 activation and co-release of IL-1ra and CXCL10/IP-10. At higher doses, the 98% DDA chitosans above 5 kDa activated the inflammasome, which lead to co-stimulation of IL-1β and PGE2 release that suppressed the type 1 IFN response. We showed that the ability of distinct chitosans to induce cytokine release depended on their ability to disrupt lysosomes once internalized by macrophages and further showed that the extent of the lysosomal disruption dictated the nature and the magnitude of the cytokine response. In summary, this thesis identifies that chitosan can be used to intensify the release of endogenous IL-1ra and IL-10 from macrophages in order to protect the joint from inflammatory mediators. The novel chitosan library generated in this thesis contributed to identifying the chitosan structural motifs required for this polysaccharide to elicit pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages and helps bridge an important gap in the litterature concerning chitosan's immune modulating properties. This increased knowledge contributes to a more effective and safer translational use of this polysaccharide in cartilage repair and other biomedical applications.