Identification des propriétés structurales du chitosane induisant la libération de cytokines pro-régénératrices chez les macrophages humains

Le cartilage articulaire possède une faible capacité de réparation intrinsèque car celui-ci est avasculaire. Initiée par un traumatisme ou une inflammation chronique de l'articulation, l'arthrose est une pathologie des articulations caractérisée par une dégradation du cartilage articulaire et de l'os sous-jacent. La stimulation osseuse est la procédure chirurgicale la plus recommandée pour traiter les lésions ostéochondrales. Cette procédure consiste à induire une réponse de guérison spontanée dans l'os sous-chondral afin d'induire le recrutement de MSC dans la lésion ostéochondrale et la génération d'un nouveau tissu cartilagineux. Présentement, il existe un besoin clinique de développer des traitements auxiliaires à la stimulation osseuse qui permettront d'augmenter le recrutement de MSC in situ et leur différenciation dans le nouveau tissu de réparation. Le chitosane est un polysaccharide composé d'unité de glucosamine et N-acétyl-glucosamine qui a été utilisé précédemment pour améliorer l'attraction des MSC et la réparation du cartilage induite par stimulation osseuse. Une étude de ces mécanismes cellulaires derrière cette meilleure réparation du cartilage a démontré que les macrophages pourraient jouer des rôles vitaux dans la meilleure réparation du tissu. Il est reconnu que les macrophages présents dans le tissu de granulation et la membrane synoviale sécrètent une vaste gamme de molécules solubles qui peuvent promouvoir le succès, ou l'échec de la réparation du cartilage. Par conséquent, les approches thérapeutiques visant à moduler le phénotype des macrophages afin que celles-ci sécrètent des cytokines anti-inflammatoires et anaboliques qui favorisent le recrutement des MSC s'avèrent prometteuses. Pour ces raisons, le chitosane est très intéressant, car celui-ci possède un potentiel immunomodulatoire important sur les cellules de l'immunité innée. Toutefois, ces propriétés immunomodulatrices sur les macrophages demeurent méconnues. Un obstacle majeur est de comprendre quelles sont les propriétés structurales du chitosane qui mènent aux réponses pro- ou anti-inflammatoires chez les macrophages. Cette thèse de doctorat vise à caractériser les interactions entre les macrophages et le chitosane afin de déterminer comment ce polysaccharide peut être utilisé pour moduler le comportement des macrophages afin d'améliorer la réparation du cartilage et maintenir l'intégrité des articulations. Les objectifs principaux de cette thèse sont de : 1) Déterminer comment le comportement des macrophages peut être modulé par le chitosane afin de stimuler chez ces cellules la libération de facteurs anti-inflammatoire et anabolique capables d'améliorer la réparation du cartilage et protéger son intégrité. 2) Générer une librairie de chitosanes possédant des propriétés structurales distinctes afin d'évaluer l'influence de ces propriétés sur la capacité des macrophages à sécréter des facteurs bénéfiques pour la réparation du cartilage. 3) Identifier les mécanismes cellulaires et les motifs structuraux du chitosane permettant à ce polysaccharide d'induire chez les macrophages des réponses anti-inflammatoires tout en minimisant l'activation de réponses pro-inflammatoire.

Dans le premier article présenté dans cette thèse, nous avons testé l'hypothèse que le chitosane biodégradable (degré de déacetylation (DDA) 80%, poids moléculaire moyen de nombre (Mn) 132 kDa) stimule les macrophages sous différents états de polarisation à sécréter des facteurs anti-inflammatoires et des molécules chimiotactiques pour les MSC. Pour cette étude, des macrophages humains U937 ont été obtenus par différenciation avec du phorbol myristate acétate (PMA) et ont été polarisées en macrophages M1 ou M2a par le biais d'une stimulation IFN-γ/LPS ou IL-4 (en présence ou absence de particules de chitosanes). Nous avons observé que la stimulation au chitosane induit la libération de cytokines bien distinctes en fonction du phénotype macrophagique de départ. Chez les macrophages M0 et M2a, le chitosane a stimulé la libération de chimiokines (CCL2/MCP-1, CXCL10/IP-10 et CCL4/MIP-1β), de cytokines anti-inflammatoires (IL-1ra et IL-10) et d'IL-1β, avec 25 à 400 fois plus d'IL-1ra que d'IL-1β. Chez les macrophages M1, le chitosane a amplifié la libération d'IL-1β sans augmenter la production d'IL-1ra. En utilisant des essais de migration in vitro, nous avons observé que les milieux conditionnés de macrophages M0 et M2a stimulent la migration des MSC tandis que les milieux conditionnés provenant des macrophages M1 sont incapables de le faire. Ensuite, nous avons testé l'hypothèse que le chitosane acétylé induit la phosphorylation des protéines STAT-1 et STAT-6 afin de conduire à la libération des facteurs CXCL10/IP-10 et IL-1ra. Nous avons observé que le chitosane stimule la libération d'IL-1ra de manière indépendante à la protéine STAT-6 tandis qu'il stimule la libération de CXCL10/IP-10 par le biais de la voie STAT-1. Cette activation, qui est différée, n'est pas observée lors que les macrophages sont stimulés avec un chitosane non biodégradable (98% DDA, Mn 128 kDa). Chez des macrophages primaires humains, l'augmentation de la production d'IL-1β et CXCL10/IP-10 par la stimulation au chitosane (80% DDA, Mn 132 kDa) était uniquement observée lorsque ces cellules étaient préalablement activées avec le PMA. En absence de PMA, la stimulation au chitosane a uniquement stimulé la production d'IL-1ra, suggérant ainsi que le chitosane stimule IL-1ra de manière indépendante à IL-1β. En adressant le premier objectif de cette thèse, nous avons démontré que le chitosane biodégradable n'altère pas la capacité intrinsèque des macrophages à attirer des MSC. Nos travaux ont identifié que le chitosane peut être utilisé pour guider les macrophages dans l'articulation à libérer de manière endogène des chimiokines et les facteurs IL-1ra et IL-10 en excès par rapport au facteur IL-1β. Dans le deuxième article, nous identifions davantage les mécanismes moléculaires et les motifs structuraux minimaux du chitosane permettant à ce polysaccharide d'augmenter la production simultanée de soit IL-1ra et IP-10, ou bien IL-1β et PGE2. Nous avons généré une libraire unique de 20 chitosanes possédant des DDA (60, 80 et 98%), patron d'acétylation (en bloc et aléatoire) et Mn (1, 3, 5, 10 et > 100 kDa) distincts et nous avons évalué leur capacité à stimuler la libération d'IP-10, IL-1ra, IL-1β et PGE2 chez des macrophages U937. Nous rapportons qu'une gamme spécifique de chitosanes (98% DDA, 3-10 kDa; 80% DDA, acétylation en bloc, 10 et 190 kDa) induis à de faibles doses une réponse IFN de type 1, qui comprend une activation paracrine de STAT-1/STAT-2 par l'IFN-β et qui mène ultimement à la libération simultanée d'IL-1ra et IP-10. À de plus fortes doses, les chitosanes de 98% de DDA dont le Mn est supérieur à 5 kDa ont stimulé l'activation de l'inflammasome. Cette activation a mené à la costimulation d'IL-1β et PGE2 qui est responsable de l'inhibition de la réponse IFN de type 1. Nous démontrons que la capacité de certaines chitosanes à induire la libération de cytokines dépend en autre de leur capacité intrinsèque à briser les lysosomes une fois internalisés dans les macrophages. La nature et l'ampleur des cytokines sécrétées dépend en autre de la sévérité de la rupture lysosomale. Pour résumer, cette thèse suggère que certains chitosanes peuvent être utilisés pour intensifier la libération endogène des facteurs IL-1ra et IL-10 à partir des macrophages activés, afin de protéger l'articulation des cytokines cataboliques comme l'IL-1β. La librairie de chitosanes générée dans cette thèse contribue à déterminer les motifs structuraux du chitosane menant à la libération de cytokines pro- et anti-inflammatoires par les macrophages et amène de nouvelles connaissances sur les propriétés immunomodulatrices du chitosane. Ces connaissances permettront d'utiliser ce biomatériau polysaccharidique de manière plus efficace et sécuritaire pour la réparation du cartilage articulaire et pour un vaste nombre d'applications biomédicales.