Optimization of LAL Assay in Plate Reader and Methods to Reduce Interference in Chitosan for Endotoxin Detection

Le lipopolysaccharide (LPS) ou endotoxine est un composant essentiel de la face externe de la membrane externe des bactéries à Gram négatif qui provoque, après administration, des symptômes dangereux chez les humains tel le choc septique et la mort. La contamination des matériaux cliniques par les endotoxines pendant les étapes de fabrication est courante, ce qui rend les ingrédients pharmaceutiques actifs non utilisables. Avant de commercialiser le produit final sur le marché, les compagnies pharmaceutiques réalisent des tests LAL (lysat d'amibocytes de Limulus polyphemus) approuvés par la FDA afin de déterminer la concentration en endotoxines. L'évaluation de la contamination des matériaux de départ à partir de chitosane pour la fabrication de nanoparticules injectables CD-ARNsi et des échafaudages CS/HA par des endotoxines est compliqué du fait des interactions positives avec les endotoxines. Un résultat faussement négatif lors du test LAL peut entrainer l'approbation du matériel mais provoquer un choc cytokinique lorsqu'il est injecté dans le corps humain. Nous avons d'abord déterminé la quantité d'endotoxines dans le chitosane de départ par des essais de gels coagulés sur LAL, une méthode semi-quantitative qui permet d'estimer la quantité d'endotoxines. Nous avons trouvé une valeur inférieure à 0.3 EU/mg pour des chitosanes de degré de désacétylation de 92% avec une grande ou petite masse molaire (10 kDa), ce qui est en dessous des limites. Si les valeurs obtenues par les essais de gels coagulés sont considérées comme absolue par la pharmacopée américaine, cette quantité limite représente un risque significatif lors de l'administration de doses plus fortes lors des tests cliniques. Cela conduit donc à utiliser des essais LAL plus sensibles, tel les tests LAL cinétiques par turbidité ou chromogène, afin d'obtenir des valeurs plus précises d'endotoxines. Dans la seconde partie, nous avons développé les essais cinétiques où des étalons sont utilisés afin d'établir une courbe d'étalonnage. La détermination de l'équation de la régression linéaire de la courbe d'étalonnage log (concentration) en fonction log (time) est déterminée, le temps reporté étant le temps nécessaire pour que l'absorbance à 405 nm atteigne une valeur prédéterminée, typiquement 0.1 pour les tests par turbidité et 0.2 pour les tests chromogènes. A cause de la nature biologique de l'enzyme LAL, la variabilité autorisée par la pharmacopée américaine est de ± 2 fois la valeur théorique, ce qui veut dire que la valeur quantifiée peut avoir une variation de 50 à 200%. Du fait de l'utilisation d'un lecteur de plaques pour effectuer les essais, différents paramètres techniques, tel la longueur du chemin optique, l'identification du taux d'évaporation dans les puits de la plaque 96 puits, le prétraitement des échantillons et la gamme de concentration de la courbe d'étalonnage ont été optimisés afin d'obtenir des équations de courbes d'étalonnage répétables. Dans la troisième partie des essais cinétiques, la quantification des endotoxines par des tests de turbidité dans un chitosane de degré de désacétylation de 92% et de grande et petite masse molaire (10 kDa) ont été développés. A cause de l'interaction entre le chitosane et les endotoxines, il a été observé une inhibition de la détection des endotoxines, appelé interférence d'inhibition. Dans le but de réduire cette inhibition, plusieurs prétraitements du chitosane ont été testés, tel le traitement par NaOH, digestion par des chitosanases aussi bien que la dépolymérisation par acide nitreux ou encore le traitement par de l'acide chlorhydrique concentré, traitement recommandé par la pharmacopée américaine. Nous avons trouvé que tous ces traitements sont délétères pour l'endotoxine libre et entrainent une réduction de la détection d'endotoxines mais nous avons découvert que le chitosane jouait un rôle de protecteur, ce qui permet d'obtenir un taux acceptable mais non total de recouvrement en endotoxines ajoutées. A partir de ces résultats, l'utilisation d'un agent neutre est préconisé afin de dissoudre le chitosane sans détruire les endotoxines libres ainsi que les libérer du chitosane pour les doser. L'utilisation d'agents dispersants, détergents ainsi que des actions afin d'affaiblir les liaisons entre le chitosanes et les endotoxines sont aussi recommandés pour les prochaines études.