Planification expérimentale dans la modélisation métabolique des cellules CHO

Bien que les cellules CHO soient principalement utilisées par l'industrie pharmaceutique actuellement pour produire la majeure partie des protéines recombinantes, ces bioprocédés présentent toujours des coûts de production élevés. Aussi, plusieurs approches sont étudiées en recherche pour améliorer les procédés de culture et de production. Mais que cela soit par l'amélioration des milieux de culture, de la génétique de la cellule ou encore des appareillages utilisés, il semble essentiel de comprendre le comportement des cellules dans leur environnement de culture et de production. De multiples études abordent déjà cette problématique, par analyse de flux métabolique et/ou par la modélisation du comportement cellulaire en lien avec leur environnement. Dans ce contexte, un modèle dynamique peut prétendre à mieux décrire le comportement du métabolisme cellulaire au cours du temps, permettant une identification des étapes de croissance, de production, de mort cellulaire etc. Ainsi, notre groupe a préalablement développé un tel modèle du métabolisme primaire des cellules CHO. Se concentrant sur le métabolisme central du carbone, ce modèle inclut les cinétiques de réaction et de régulation des multiples flux métaboliques considérés. Le modèle comportant un très grand nombre d'inconnues par rapport à ses variables, il est très sous-déterminé et ainsi est très dépendant des mesures intra et extracellulaires obtenues pour le calibrer. Cependant les expérimentations sur les cellules CHO sont coûteuses et prennent du temps, il convient donc de s'assurer que des mesures supplémentaires améliorent en effet notre modèle. Dans ce contexte, la planification expérimentale est très efficace, car elle fournit une méthode qui a pour but de déterminer précisément une ou plusieurs expériences avec des paramètres d'entrée (composition du milieu, température etc.) identifiés et contrôlés, et dont les mesures expérimentales permettent de réduire l'erreur de détermination sur les paramètres calculés du modèle. Ce mémoire présente ainsi le travail de planification expérimentale effectuée sur une lignée de cellules CHO haute productrice. À partir du modèle déjà développé, une analyse de sensibilité a été faite sur l'ensemble des paramètres du modèle dans le but d'identifier ceux qui influencent le plus la qualité du modèle dans sa globalité. Ces paramètres sont ensuite re-identifiés à partir des données déjà produites, pour s'assurer que le modèle simule correctement. Par la suite une première étude a révélé que l'oxygène est un facteur de contrôle très intéressant pour une planification expérimentale, mais il convient de confirmer la bonne modélisation du comportement cellulaire vis-à-vis de celui-ci. Ainsi des expériences de respiration cellulaire ont permis de déterminer l'affinité des cellules CHO à l'oxygène et leur résistance à un milieu hypoxique. Les cellules présentent ainsi une haute affinité à l'oxygène et peuvent rester longtemps en hypoxie sans mourir. La grande affinité des cellules à l'oxygène nous indique alors qu'une coupure d'oxygène pendant la croissance d'une culture de cellules est un bon moyen de créer une perturbation suffisante pour générer de nouvelles données intéressantes. En effet l'idée de la planification expérimentale est de trouver comment générer des données autres que celles déjà utilisées précédemment, permettant ainsi de modéliser correctement le maximum de cas possibles. Ainsi la planification expérimentation finale a été effectuée sur une simulation de coupure d'oxygène avec la durée et le temps de début de cette coupure comme paramètres d'entrées. Il a été révélé que le temps de la coupure devra être autour de quatre heures, et que la coupure est plus efficace pendant la phase exponentielle.

Abstract

Despite the fact that CHO cells are the main platform currently used by pharmaceutical industry to produce most of the recombinant proteins, the bioprocesses used are still costly. Also, many approaches have been studied in order to improve the culture and production processes. But by either the improvement of culture medium, cell genetic modifications or machinery used, it seems essential to understand the cells behavior in their culture and production environment. Multiple studies have already taken on this subject through the metabolic flux analysis and their modeling in relationship with their environment. In this context, a dynamical model could better describe the cellular metabolism through time, allowing an identification of different phases such as growth, production, apoptosis. Therefore our group previously developed such a model, describing the central carbon metabolism of CHO cells. This model includes the reactions kinetics and regulations of the multiple metabolic fluxes it simulates. The model possesses a large number of unknown parameters compared to its variables, it is largely underdetermined and therefore very dependent on collected data. But experiments on CHO cells are costly and time-consuming, it is then important to make sure that supplementary measures will be beneficial for the model. In this context experimental planning is very efficient, because it describes a way to precisely determine one or more experiments which input parameters (medium composition, temperature, etc.) are identified and controlled, and from which we can extract experimental measures allowing to reduce the fitting error on calculated model parameters. This dissertation presents the work done on the experimental planning applied to a high producing CHO cell line. From the already developed model, a sensitivity analysis has been done on the whole set of parameters in order to identify the ones that have the most influence on the global quality of the model. These parameters are then identified again from available data, to make sure that the model correctly fits the data. Next a first study revealed that oxygen is an interesting control factor for an experimental planning, but it is important to make sure the good modeling of the cell behavior towards oxygen. Therefore respiratory experiments were conducted and allowed to determine cells oxygen affinity and their resistance to an hypoxic environment. The cells have a high affinity to oxygen and can last long without it and not die. The cells high oxygen affinity reveals that an oxygen deprivation during cell growth is a good way to entail a sufficient perturbation that will generate new interesting data. Indeed the idea behind experimental planning is to generate new data that differ from those previously used, and therefore allowing to correctly model different culture conditions. With this in mind, the final experimental planning has been implemented with the time and duration of an oxygen deprivation as input parameters. It has been found that a four-hours-long cut during the exponential phase is the most efficient way to improve the model.