Études des interactions entre les immunoglobulines G et leurs récepteurs Fc gamma afin d'évaluer le patron de glycosylation des anticorps

Avec plusieurs brevets qui arriveront à échéance dans les prochaines années, un nombre grandissant de compagnies biopharmaceutiques a démarré des programmes de développement d'anticorps biosimilaires. Ces molécules thérapeutiques doivent répondre à plusieurs critères imposés par les agences de santé, comme un profil de glycosylation « adéquat ». Ainsi, plusieurs études se sont penchées sur les mécanismes cellulaires de la glycosylation afin de comprendre ce processus et de mieux le contrôler. C'est dans ce contexte qu'est né le réseau pancanadien MabNet auquel ce projet est rattaché. Cette thèse de doctorat s'inscrit dans la section analytique du réseau et a pour objectif de développer un essai cinétique et/ou thermodynamique fiable afin d'évaluer le patron de glycosylation de différents lots d'anticorps monoclonaux. Pour se faire, les interactions entre les domaines extracellulaires des récepteurs Fcγ et les anticorps monoclonaux ont été caractérisées en utilisant un biocapteur capable de les suivre en temps réel. Dans le cadre de ce travail, nous avons tout d'abord produit et purifié les domaines extracellulaires des récepteurs FcγRI et FcγRIIIa comprenant une étiquette histidine par transfection transitoire dans les cellules de mammifère. Ces récepteurs sont utilisés dans un essai analytique de détection par résonance des plasmons de surface (SPR) afin d'évaluer les profils de glycosylation et l'état d'agrégation des anticorps monoclonaux. Ce travail a été publié dans le « Journal of Immunological Methods » en 2014. Ces travaux ont aussi été présentés lors de la conférence canadienne de génie chimique en 2012 en tant que présentateur invité (CSChE, Vancouver) et lors de la conférence internationale « Protein Expression in Animal Cell » en 2013 (PEACe, Kananaskis). Plus particulièrement, nous nous sommes attardés à comparer l'immobilisation covalente par les amines des récepteurs à la surface du biocapteur et la capture orientée de ceux-ci grâce à un anticorps anti-histidine qui reconnaît l'étiquette histidine des récepteurs. Le greffage non orienté engendre des cinétiques plus complexes possiblement causées par la présence de plusieurs populations à la surface du biocapteur. Malgré l'amélioration de l'essai en utilisant une capture orientée du récepteur, les cinétiques obtenues n'étaient toujours pas décrites adéquatement par un modèle simple de Langmuir (1 :1), car l'association de l'anticorps avec le récepteur diminue l'affinité entre ce dernier et l'agent de capture. Ainsi, le récepteur se dissocie partiellement de l'agent de capture lors de l'injection de l'anticorps à évaluer. La capture via un anticorps anti- vii histidine n'est pas idéale et une autre approche expérimentale devait être envisagée afin d'éliminer ces artéfacts. Cette étude initiale nous a aussi permis de mettre en évidence l'intérêt d'un test SPR pour détecter la présence d'agrégats dans les lots d'anticorps purifiés. Ceci est une alternative intéressante à une analyse par ultracentrifugation analytique puisqu'elle requiert moins de matériel et permet l'évaluation de la bioactivité simultanément. Dans un second manuscrit publié en 2016 dans le « Journal of Molecular Recognition », une approche utilisant la forte affinité entre la biotine et la streptavidine pour capturer les récepteurs à la surface de la SPR a été exploitée. Ces travaux ont aussi été présentés lors de la conférence internationale Cell Culture Engineering en 2014 (CCE, Quebec). Nous avons tout d'abord développé un protocole de biotinylation in-cell des récepteurs FcγRs afin d'éviter la réaction enzymatique in vitro et une étape de purification subséquente. La méthodologie consiste à co-transfecter des cellules de mammifère en utilisant deux plasmides codant l'un pour l'enzyme BirA (qui permet la biotinylation) et l'autre pour le récepteur ayant une séquence peptidique reconnue par l'enzyme (et qui sera biotinylée) en C-terminal. Comparativement aux techniques utilisées dans d'autres études, notre approche expérimentale de biotinylation in-cell par co-transfection permet d'ajuster les ratios enzyme-substrat afin d'optimiser les rendements finaux. Les résultats obtenus par ultracentrifugation analytique indiquent que la conformation du récepteur n'est pas influencée par la méthode développée et cette hypothèse est aussi validée par nos études SPR. Les quatre récepteurs biotinylés (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb et FcγRIIIaF158) ont été produits et capturés à la surface du biocapteur. Cette approche a permis de capturer les récepteurs de manière très stable par rapport à notre approche SPR basée sur l'utilisation d'un anticorps anti-histidine. Cependant, les interactions anticorps-récepteurs dévient toujours du modèle cinétique simple. Malgré cette déviation, nous avons pu évaluer de manière semi-quantitative les profils de glycosylation (analysés par spectrométrie de masse à l'Université du Manitoba) des anticorps, en enregistrant leurs cinétiques d'interaction avec les récepteurs FcγRI et FcγRIIIa. Dans une troisième étude, en collaboration avec Céline Raymond (étudiante à l'Université de Montréal) qui sera soumise pour publication dans les prochaines semaines, notre test SPR a été utilisé afin d'évaluer les différents profils de glycosylation de notre anticorps modèle (TZM). L'anticorps cible l'antigène HER2 présent à la surface de certaines cellules cancéreuses, notamment lors du cancer du sein. En tout, huit TZM présentant différents patrons de glycosylation ont été analysés par notre approche SPR et il a été possible de corréler ces résultats à ceux obtenus viii grâce à des tests cellulaires d'ADCC. Le test ADCC est un test de substitution, utilisant des cellules surexprimant le récepteur FcγRIIIaF158 ayant un gène rapporteur qui permet de corréler la fluorescence à l'interaction anticorps/récepteur. Ces résultats complémentaires viennent confirmer la validité et l'intérêt de la méthodologie que nous avons développée pour caractériser les interactions FcγR-immunoglobuline et prédire leur comportement. Enfin, dans une quatrième étude soumise pour publication dans le « Journal of Immunological Methods », nous avons utilisé la même approche de capture (biotine-streptavidine) afin de caractériser la production d'un anticorps à même le surnageant d'une culture cellulaire. En un seul cycle d'injections, nous avons pu, grâce à notre approche, quantifier l'anticorps dans le surnageant et vérifier la capacité de ses portions Fc et Fab de se lier à leurs partenaires biologiques respectifs, à savoir, FcγRI et l'antigène. A ce jour, aucune méthodologie fiable pour contrôler le processus de glycosylation des protéines n'a été développée. Les travaux présentés dans cette thèse permettent d'évaluer rapidement l'impact de la glycosylation sur la bioactivité des anticorps. L'essai analytique développé est d'un intérêt majeur, car il peut être mis en place pour assurer le suivi « en ligne » ou « hors ligne » de la qualité des protéines produites dans un procédé établi ou encore pour le développement d'un biosimilaire. De plus, cet essai pourrait être adapté et utilisé pour d'autres types de glycoprotéines.