Études des interactions entre les immunoglobulines G et leurs récepteurs Fc gamma afin d'évaluer le patron de glycosylation des anticorps

Avec plusieurs brevets qui arriveront à échéance dans les prochaines années, un nombre grandissant de compagnies biopharmaceutiques a démarré des programmes de développement d'anticorps biosimilaires. Ces molécules thérapeutiques doivent répondre à plusieurs critères imposés par les agences de santé, comme un profil de glycosylation « adéquat ». Ainsi, plusieurs études se sont penchées sur les mécanismes cellulaires de la glycosylation afin de comprendre ce processus et de mieux le contrôler. C'est dans ce contexte qu'est né le réseau pancanadien MabNet auquel ce projet est rattaché. Cette thèse de doctorat s'inscrit dans la section analytique du réseau et a pour objectif de développer un essai cinétique et/ou thermodynamique fiable afin d'évaluer le patron de glycosylation de différents lots d'anticorps monoclonaux. Pour se faire, les interactions entre les domaines extracellulaires des récepteurs Fcγ et les anticorps monoclonaux ont été caractérisées en utilisant un biocapteur capable de les suivre en temps réel. Dans le cadre de ce travail, nous avons tout d'abord produit et purifié les domaines extracellulaires des récepteurs FcγRI et FcγRIIIa comprenant une étiquette histidine par transfection transitoire dans les cellules de mammifère. Ces récepteurs sont utilisés dans un essai analytique de détection par résonance des plasmons de surface (SPR) afin d'évaluer les profils de glycosylation et l'état d'agrégation des anticorps monoclonaux. Ce travail a été publié dans le « Journal of Immunological Methods » en 2014. Ces travaux ont aussi été présentés lors de la conférence canadienne de génie chimique en 2012 en tant que présentateur invité (CSChE, Vancouver) et lors de la conférence internationale « Protein Expression in Animal Cell » en 2013 (PEACe, Kananaskis). Plus particulièrement, nous nous sommes attardés à comparer l'immobilisation covalente par les amines des récepteurs à la surface du biocapteur et la capture orientée de ceux-ci grâce à un anticorps anti-histidine qui reconnaît l'étiquette histidine des récepteurs. Le greffage non orienté engendre des cinétiques plus complexes possiblement causées par la présence de plusieurs populations à la surface du biocapteur. Malgré l'amélioration de l'essai en utilisant une capture orientée du récepteur, les cinétiques obtenues n'étaient toujours pas décrites adéquatement par un modèle simple de Langmuir (1 :1), car l'association de l'anticorps avec le récepteur diminue l'affinité entre ce dernier et l'agent de capture. Ainsi, le récepteur se dissocie partiellement de l'agent de capture lors de l'injection de l'anticorps à évaluer. La capture via un anticorps anti- vii histidine n'est pas idéale et une autre approche expérimentale devait être envisagée afin d'éliminer ces artéfacts. Cette étude initiale nous a aussi permis de mettre en évidence l'intérêt d'un test SPR pour détecter la présence d'agrégats dans les lots d'anticorps purifiés. Ceci est une alternative intéressante à une analyse par ultracentrifugation analytique puisqu'elle requiert moins de matériel et permet l'évaluation de la bioactivité simultanément. Dans un second manuscrit publié en 2016 dans le « Journal of Molecular Recognition », une approche utilisant la forte affinité entre la biotine et la streptavidine pour capturer les récepteurs à la surface de la SPR a été exploitée. Ces travaux ont aussi été présentés lors de la conférence internationale Cell Culture Engineering en 2014 (CCE, Quebec). Nous avons tout d'abord développé un protocole de biotinylation in-cell des récepteurs FcγRs afin d'éviter la réaction enzymatique in vitro et une étape de purification subséquente. La méthodologie consiste à co-transfecter des cellules de mammifère en utilisant deux plasmides codant l'un pour l'enzyme BirA (qui permet la biotinylation) et l'autre pour le récepteur ayant une séquence peptidique reconnue par l'enzyme (et qui sera biotinylée) en C-terminal. Comparativement aux techniques utilisées dans d'autres études, notre approche expérimentale de biotinylation in-cell par co-transfection permet d'ajuster les ratios enzyme-substrat afin d'optimiser les rendements finaux. Les résultats obtenus par ultracentrifugation analytique indiquent que la conformation du récepteur n'est pas influencée par la méthode développée et cette hypothèse est aussi validée par nos études SPR. Les quatre récepteurs biotinylés (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb et FcγRIIIaF158) ont été produits et capturés à la surface du biocapteur. Cette approche a permis de capturer les récepteurs de manière très stable par rapport à notre approche SPR basée sur l'utilisation d'un anticorps anti-histidine. Cependant, les interactions anticorps-récepteurs dévient toujours du modèle cinétique simple. Malgré cette déviation, nous avons pu évaluer de manière semi-quantitative les profils de glycosylation (analysés par spectrométrie de masse à l'Université du Manitoba) des anticorps, en enregistrant leurs cinétiques d'interaction avec les récepteurs FcγRI et FcγRIIIa. Dans une troisième étude, en collaboration avec Céline Raymond (étudiante à l'Université de Montréal) qui sera soumise pour publication dans les prochaines semaines, notre test SPR a été utilisé afin d'évaluer les différents profils de glycosylation de notre anticorps modèle (TZM). L'anticorps cible l'antigène HER2 présent à la surface de certaines cellules cancéreuses, notamment lors du cancer du sein. En tout, huit TZM présentant différents patrons de glycosylation ont été analysés par notre approche SPR et il a été possible de corréler ces résultats à ceux obtenus viii grâce à des tests cellulaires d'ADCC. Le test ADCC est un test de substitution, utilisant des cellules surexprimant le récepteur FcγRIIIaF158 ayant un gène rapporteur qui permet de corréler la fluorescence à l'interaction anticorps/récepteur. Ces résultats complémentaires viennent confirmer la validité et l'intérêt de la méthodologie que nous avons développée pour caractériser les interactions FcγR-immunoglobuline et prédire leur comportement. Enfin, dans une quatrième étude soumise pour publication dans le « Journal of Immunological Methods », nous avons utilisé la même approche de capture (biotine-streptavidine) afin de caractériser la production d'un anticorps à même le surnageant d'une culture cellulaire. En un seul cycle d'injections, nous avons pu, grâce à notre approche, quantifier l'anticorps dans le surnageant et vérifier la capacité de ses portions Fc et Fab de se lier à leurs partenaires biologiques respectifs, à savoir, FcγRI et l'antigène. A ce jour, aucune méthodologie fiable pour contrôler le processus de glycosylation des protéines n'a été développée. Les travaux présentés dans cette thèse permettent d'évaluer rapidement l'impact de la glycosylation sur la bioactivité des anticorps. L'essai analytique développé est d'un intérêt majeur, car il peut être mis en place pour assurer le suivi « en ligne » ou « hors ligne » de la qualité des protéines produites dans un procédé établi ou encore pour le développement d'un biosimilaire. De plus, cet essai pourrait être adapté et utilisé pour d'autres types de glycoprotéines.

Abstract

With several patents expiring within the next years, an increasing number of biopharmaceutical companies have started producing biosimilar antibodies. These therapeutic molecules must meet several criteria for health agencies, such as the obtainment of a “desirable” glycosylation pattern, which still represents a challenge for the industry in terms of control and characterization. It is in this context that the Canadian network MabNet, to which this project belongs, was born. This thesis is part of the analytical activities of the network and aims to develop a kinetic and/or reliable thermodynamic assay to evaluate the glycosylation profiles of different monoclonal antibodies. In this endeavour, the interactions between the extracellular domains of Fcγ receptors and monoclonal antibodies have been explored using a surface plasmon resonance (SPR)- based biosensor. In an initial study, we have produced and purified the extracellular domains of both his-tagged FcγRI and FcγRIIIa receptors by transient transfection in mammalian cells. These receptors were used in an analytical surface plasmon resonance (SPR)-based assay to evaluate the glycosylation patterns and the aggregation state of the monoclonal antibodies. This work was published in the “Journal of Immunological Methods” in 2014. These results have also been presented during the “Canadian Conference of Chemical Engineering” in 2012 as the Keynote speaker (CSChE, Vancouver) and during the international conference named “Protein Expression in Animal Cell” in 2013 (PEACe, Kananaskis). More precisely, the comparison between the covalent immobilization of the receptors and their oriented capture via an anti-Histidine antibody (which associates with the his-tag) was performed by SPR. The non-oriented grafting of the receptor ectodomains was shown to generate complex kinetics, more likely due to the presence of several receptor populations at the biosensor surface as a result of the non-oriented chemical immobilization. A receptor capture approach based on anti-Histidine antibody greatly improved the assay, however, the kinetic still deviated from the Langmuir model (1:1). This deviation was due to the fact that, upon antibody binding, the affinity of the receptor ectodomain for the capture anti-His antibody diminished, resulting in receptor dissociation from the surface of the SPR instrument. These results suggest that capturing receptors via an anti-Histidine antibody is not ideal: another capture strategy should be considered to eliminate this artefact. This initial study also allowed us to highlight that a SPR assay is an interesting alternative to analytical ultracentrifugation analysis for the detection of aggregates x in purified antibody batches as it requires less material for analysis and the bioactivity is being assessed at the same time. In a second manuscript published in 2016 in the “Journal of Molecular Recognition”, an approach using the strong affinity between biotin and streptavidin to capture receptors onto the biosensor surface is described. These results have been presented during the international conference “Cell Culture Engineering” in 2014 (CCE, Quebec City). We first developed an in-cell FcγR biotinylation protocol which allows the elimination of the enzymatic in vitro biotinylation and an additional purification steps. The methodology is based on the co-transfection of mammalian cells with two plasmids encoding the BirA enzyme (responsible for biotinylation) and the receptor tagged with a specific peptide sequence (to be biotinylated) at its C-terminus. Compared to the techniques developed by other groups, our experimental in-cell biotinylation approach allows the fine tuning of the enzyme:substrate ratios in order to optimize the production yields. Investigations performed by analytical ultracentrifugation suggested that the conformation of the receptor we produced is not affected by tag/biotin addition, which was later confirmed by SPR. The four biotinylated receptors (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb and FcγRIIIaF158) were produced and tethered to streptavidin-derivatized SPR surfaces. This capture strategy significantly improved the quality of the kinetics we recorded when injecting antibodies (compared to the previous assay we designed with an anti-Histidine experimental approach). However, the antibody-receptor interactions still deviated from a simple kinetic model, more likely due to the presence of various glycoforms (analyzed by mass spectrometry at University of Manitoba) within the antibody lots we tested. Our assay was however applied to evaluate the glycosylation impact on the binding of monoclonal antibody preparations to the FcγRI and FcγRIIIa ectodomains. In a third study to be submitted for publication in the coming weeks, in collaboration with Céline Raymond (student at Université de Montréal), our biotin-streptavidin capture strategy was applied to the characterization of different TZM antibody preparations. TZM targets HER2, an antigen present on the surface of some cancer cells, especially breast cancer. Eight TZM that harboured distinct glycosylation patterns were analyzed by SPR. Of salient interest, the SPR results with captured FcγRIIIa could be correlated to those generated in an ADCC assay performed with cells over-expressing the same receptor. Using a reporter gene, it was possible to correlate the fluorescence and the antibody/receptor binding. These additional results confirmed the validity and xi relevance of the methodology we developed to characterize the antibody-FcγR interactions in order to predict antibody behaviour in ADCC assays. A fourth study submitted for publication to the “Journal of Immunological Methods” uses the same capture approach (biotin-streptavidin) to characterize the production of an antibody in the supernatant of a mammalian cell culture. In this study, we highlighted that, within a single cycle of injections, one may quantify the TZM in the supernatant and verify the antibody ability to bind its receptor and related antigen via its Fc and Fab portions, respectively. To date, there is no trustable methodology developed to control the glycosylation process of proteins. The work presented in this thesis allows the assessment of the glycosylation impact on the bioactivity of antibodies. The analytical assay described is of great interest because it can be set up to monitor "online" or "offline" the quality of the protein produced in an established process or for the development of a biosimilar. Furthermore, this assay could be modified and used with other types of glycoproteins.