Silençage du gène ApoB codant pour l'apolipoprotéine B responsable de l'athérosclérose, in vitro et in vivo, à l'aide des nanoparticules chitosane/siARN-ApoB

L'athérosclérose est une cause sous-jacente des maladies cardiovasculaires. Le nombre de décès causés par ces maladies est estimé à 17,3 millions soit 30% de la mortalité mondiale totale. L'apolipoprotéine B (ApoB) joue un rôle important dans l'initiation de l'athérosclérose. En fait, c'est le précurseur des lipoprotéines à faible densité (LDL) responsables de l'activation de l'athérosclérose quand ils s'infiltrent dans l'espace sous-endothélial et s'oxydent. La réduction de l'ApoB dans le sang diminue le risque de l'athérosclérose. L'utilisation des siARN est prometteuse pour silençer le gène ApoB et pour prévenir la maladie. Toutefois, les siARN sont facilement dégradables dans le sang. Ce qui peut diminuer leur efficacité. Le chitosane, un polymère cationique naturel et biodégradable, peut servir comme un système de livraison des siARN jusqu'à l'intérieure des cellules cibles. Le chitosane est caractérisé par ses propriétés physicochimiques notamment le DDA, la MM et le ratio N : P. La formulation du chitosane est écrite comme suit : DDA-MM-N : P. Dans notre étude, les formulations utilisées sont 80-10-5, 80-40-5, 92-10-5 et 92-40-5. De plus, nous avons choisi trois siApoB modifiés ou non modifiés chimiquement. Les 12 nanoparticules ont été testées à fin de sélectionner la moins toxique et la plus efficace. Le diamètre des nanoparticules tel que déterminé par DLS varie entre 71 et 135 nm. Les nanoparticules formées de chitosane et des siApoB qui contiennent le plus de modifications chimiques 2'-O-méthylation et des liaisons phosphotioates sont de plus grandes tailles. L'ESEM montre que les nanoparticules sont sphériques et confirme que les siApoB modifiés forment avec le chitosane des nanoparticules de taille plus grande que les nanoparticules chitosane/siApoB non modifiés. Le potentiel ζ des nanoparticules est positif et varie entre +19 et +31 mV. Le test de stabilité démontre que le chitosane peut former des nanoparticules stables à pH 6,5 avec tous les siApoB. Le test de cytotoxicité AlamarBlue® montre que les nanoparticules chitosane/siApoB sont moins toxiques que les nanoparticules à base de l'agent commercialisé de transfection DharmaFECT® complexé avec les siApoB. La microscopie confocale prouve que les nanoparticules chitosane/siApoB sont capables de franchir la membrane cellulaire et l'endosome pour libérer les siApoB dans le cytoplasme des cellules HepG2. La cytométrie en flux montre que le chitosane 92-40-5 complexé avec les siApoB modifiés et non modifiés transfecte mieux les cellules HepG2 que DharmaFECT® complexé avec les mêmes siARN. La qRT-PCR démontre que les nanoparticules 92-40-5/siApoB et 92-10-5/siApoB peuvent induire un silençage de plus

Abstract

Atherosclerosis is an underlying cause of cardiovascular disease. The number of deaths caused by these diseases is estimated at 17,3 million or 30% of total global mortality. Apolipoprotein B (ApoB) plays an important role in the initiation of atherosclerosis. In fact, it is the precursor of low-density lipoprotein (LDL) responsible for the activation of atherosclerosis when they seep into the subendothelial space and oxidize. ApoB reduction in blood reduces the risk of atherosclerosis. The use of siRNA is promising to silence the ApoB gene and prevent disease. Nevertheless, siRNA are easily degradable in the blood. This may decrease their effectiveness. Chitosan, a natural and biodegradable cationic polymer, is able to serve as a delivery system of siRNA to the interior of target cells. Chitosan is characterized by its physicochemical properties, including DDA, the MW and N: P ratio. Chitosan's formulations are written as DDA-MW-N: P. In this study, chitosan's formulations used are 80-10-5, 80-40-5, 92-10-5 and 92-40-5. Furthermore, we selected three siApoB either chemically modified or not. Chitosan/siApoB nanoparticles were tested in order to select the least toxic and most effective. Chitosan/siApoB nanoparticles diameter, as determined by DLS, varies between 71 and 135 nm. Nanoparticles that contain the most chemically modified siApoB are larger. ESEM shows that nanoparticles are spherical and confirms that modified siApoB form nanoparticles with larger size than chitosan/siApoB unmodified nanoparticles. The ζ potential of nanoparticles is positive and varies between +19 and +31 mV. Stability test showed that chitosan can form stable nanoparticles at pH 6,5. AlamarBlue® cytotoxicity test shows that chitosan/siApoB nanoparticles are less toxic than DharmaFECT®/siApoB. Confocal microscopy shows that chitosan/siApoB nanoparticles are able to cross the cell membrane and to release siApoB into the cytoplasm of HepG2 cells. Flow cytometry showed that chitosan 92-40-5 complexed with modified and unmodified siApoB transfected HepG2 cells better than the commercially available transfection agent DharmaFECT® with the same siApoB. The qRT-PCR shows that 92-40-5/siApoB and 92- 10-5/siApoB can induce more than 60% of ApoB gene silencing in vitro. This efficiency is comparable to DharmaFECT®/siApoB. In vitro study has also shown that chemical modifications of siRNA did not affect the efficiency of transfection, the percentage of silencing and toxicity of chitosan/siApoB nanoparticles. We have shown that 92-10-5/siApoB1 nanoparticules are effective to silence ApoB gene in vivo. Three injections during three successive days at a dose of 1 mg/kg of chitosane 92-10-5/siApoB