Fabrication and Surface Modification of Poly L-Lactic Acid Nanostructures for Growth Factor Immobilization and Neural Stem Cell Delivery

Les accidents vasculaires cérébraux, le cancer et la maladie d'alzheimer sont les principales causes de décès au Canada. Les lésions nerveuses ou les nerfs endommagés dans le système nerveux central peuvent détruire la qualité de vie des survivants, présentent de grands couts pour la société et peuvent entraîner la mort. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace encore pour aider à la régénération des tissus nerveux. Les stratégies de régénération des tissus nerveux ont été étudiées, cependant, de nombreuses limites ont été rencontrées. Par exemple, l'injection directe de cellules souches neuronales dans le système nerveux central a donné lieu à la formation de tumeurs. L'injection directe de facteurs de croissance n'a révélé aucun bénéfice avant sept jours de traitement continu. En outre, l'encapsulation des facteurs de croissance a été précédemment étudiée et possède des inconvénients majeurs. Des limites telles que, la difficulté à maintenir leur livraison à long terme sur une gamme de concentration définie, leur courte demi-vie ainsi qu'une courte distance de migration ont été observées. La production in situ et la distribution de facteur de croissance par l'intermédiaire de cellules telles que les fibroblastes modifiés génétiquement pour exprimer le BDNF ainsi que les cellules fabriquées en coculture ont aussi démontré des inconvénients majeurs. En effet l'immunosuppression était constamment requise et le taux de survie des cellules très faible. Les biomatériaux tels que les hydrogels ont été largement étudiés et présentent des difficultés de manipulations, une faible adhérence, des couts élevés, des difficultés à incorporer des médicaments sur leur structure ainsi que de présenter des difficultés lors de leurs stérilisations. Cette étude vise donc à optimiser les stratégies de régénération des tissus nerveux existants. Les biomatériaux électrofilés ont montré des résultats prometteurs dans la littérature en raison de leur porosité, haut rapport surface-volume, interconnexion des pores ainsi que de leur topographie imitant la matrice extracellulaire (ECM) du cerveau. Ces biomatériaux électrofilés v ont donc été utilisés dans ce projet. Le procédé d'électrofilage a été utilisé dans cette étude afin d'obtenir des fibres dans la gamme nanométrique présentant une topologie à haute porosité, le diamètre des fibres idéales ainsi qu'une résistance mécanique adéquate. L'acide poly lactique-L (PLLA) est étudié dans cette recherche; il s'agit d'un polymère couramment utilisé dans l'ingénierie tissulaire neurale étant donné qu'il est autorisé par la FDA et a été utilisé sous la forme de nanofibres électrofilées. Des études antérieures ont utilisé d'autres protéines pour l'immobilisation tels que la laminine et le collagène. Ces résultats, cependant, n'étaient pas prometteurs et nécessitaient l'addition de facteurs de croissance dans les médias. Par conséquent, dans ce travail, les nanofibres de PLLA électrofilées ont été optimisées par greffage de manière covalente du facteur de croissance épidermique (EGF) puisque EGF a montré des résultats prometteurs dans des études précédentes. Les nanofibres de PLLA électrofilées ont d'abord été fonctionnalisées avec polyallylamine pour introduire des groupes amine. Ensuite, le greffage de l'EGF par l'intermédiaire d'un ester de glycol de bis-N-succinimidyle pentaéthylène (PEG) espaceur est effectué. Le substrat est resté physiquement intact et le diamètre moyen de fibres ainsi que la porosité est restés inchangés après la fonctionnalisation de groupes d'amine. Ceci est en contraste frappant avec les protocoles d'amination se fondant sur un traitement au plasma qui a rapporté une dégradation du PLLA ou aminolyse au moyen de la petite molécule ethlynediamine (EtDA). Des cellules souches d'ingénérie ressemblant à des cellules souches neuronales (NSLC) ont ensuite été ensemencées sur les substrats modifiés et se sont avérées viables jusqu'à 14 jours. Leur prolifération ainsi que leur propagation ont été observées. L'adhérence cellulaire et la prolifération sont supérieures lorsque les substrats ont été greffés avec de l'EGF en comparaison à des substrats qui ont été seulement aminés. Comme témoin positif, la prolifération des NSLC a été caractérisée sur des nanofibres de laminine dans du milieu dépourvu de EGF. Aucune différence significative dans la prolifération des cellules entre les substrats de type EGF greffé et le témoin positif n'a été observée. Par conséquent, ce nouveau biomatériau fonctionnalisé et vi greffé du EGF démontre une adhésion cellulaire efficace, une prolifération ainsi que la viabilité des cellules jusqu'à 14 jours et présente une avenue prometteuse dans le traitement de la régénération de cellules souches.

Abstract

Damaged nerves and nerve injuries in the Central Nervous System (CNS) diminish the quality of life of survivors, are costly to society, and can cause death. Strokes, cancer, and Alzheimer's Disease (AD) are the leading causes of death in Canada. There is currently still no efficient treatment to aid in the neural tissue regeneration of damaged nerve cells. Previous nervous tissue regeneration strategies have been studied, however, many limitations were encountered. For example, direct injection of neural stem cells into the central nervous system (CNS) has resulted in tumor formation. Direct injection of growth factors showed no benefits until after seven days of continuous treatments. Furthermore, the encapsulation of growth factors was previously studied and demonstrated major drawbacks. Some limitations, such as the difficulty to maintain long-term delivery within a defined concentration range, as well as the short half-life of the growth factors and short migration distance were observed. Additionally, the in situ production and delivery of growth factors using cells, such as the transplantation of genetically modified fibroblasts to express BDNF, as well as the co-culturing of cells have also seen some drawbacks. Immune suppression was constantly needed and low cell survival rate was observed. Furthermore, biomaterials such as hydrogels have been widely studied and proved to be difficult to handle and sterilize, load drugs and nutrients, are nonadherent, and expensive. This study thus aims at optimizing existing nervous tissue regeneration strategies. Electrospun biomaterials have shown promising results in literature due to its high porosity, high surface area-to-volume ratio, interconnected pores, and topography that mimic extra cellular matrix (ECM) in the brain. The electrospinning process was used in this study to obtain the desired qualities mentioned, as well as to obtain fibers in the nano-metric range. Poly L-lactic acid (PLLA) is a polymer commonly used in neural tissue engineering, since it is FDA-approved and was used as a form of electrospun nanofibers in this study. Previous studies have used other proteins for immobilization such as laminin and collagen. These results, however, were not promising and most often required the addition of growth factors in the media as well. Therefore, in this work, the electrospun PLLA nanofibers were optimized by covalently grafting epidermal growth factor (EGF) since EGF has shown promising results in previous studies. viii The electrospun PLLA nanofibers were first functionalized with polyallylamine to introduce amine groups, before EGF grafting via a bis-N-succinimidyl-pentaethylene glycol ester (PEG) linker. The substrate remained physically intact, the average fiber diameter (AFD) and porosity also remained unchanged following amine functionalization. This is in stark contrast with amination protocols relying on plasma treatment that has been reported to degrade PLLA or aminolysis using the small molecule ethylenediamine (EtDa). Engineered neural stem-like cells (NSLC) were then seeded onto the modified substrates and were shown to be viable up to 14 days, while proliferating and spreading. Cell adhesion and proliferation was improved when substrates were grafted with EGF, when compared to substrates that were only aminated. As a positive control, NSLC proliferation was also characterized on laminin-coated mats in EGF-free medium where no significant differences in cell proliferation were observed between the EGF-grafted substrates and the positive control. Therefore, this new functionalized and EGF-grafted biomaterial has achieved efficient cell adhesion, proliferation as well as cell viability for up to 14 days and has promising use in stem cell regeneration therapy