Highly Structured and Surface Modified Poly (e-Caprolactone) Scaffolds Derived from Co-Continuous Polymer Blends for Bone Tissue Engineering

L'utilisation d'échafaudages tridimensionnels poreux ensemencés avec des cellules ostéoprogénitrices, telles que les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) pour la régénération des os, est devenue un outil prometteur pour l'ingénierie tissulaire osseuse. Les échafaudages dans l'ingénierie tissulaire osseuse agissent à titre de structure facilitant l'attachement, la migration, et la distribution des cellules hôtes impliquées dans le processus de réparation osseuse. Ces structures poreuses doivent être biocompatibles, biodégradables et doivent idéalement avoir une chimie de surface favorable, un niveau élevé d'interconnectivité des pores, des pores au diamètre favorable et finalement une distribution étroite de la taille des pores. Parmi une panoplie de matériaux synthétiques et naturels proposés pour l'ingénierie tissulaire osseuse, le poly(ε-caprolactone) (PCL) a été largement utilisé à cette fin grâce à sa biocompatibilité, sa basse immunogénicité, sa lente biodégradation et sa stabilité mécanique allant jusqu'à trois ans in vivo. Différentes techniques de fabrication ont été utilisées afin de produire des échafaudages pour l'ingénierie tissulaire osseuse, telles que le frittage, la coulée avec un solvant suivi du lessivage des particules, le moussage, et le prototypage rapide. Ces méthodes présentent habituellement de nombreux inconvénients comme l'utilisation de solvants toxiques, les limitations imposées par la forme de la phase de l'agent porogène, le niveau faible d'interconnectivité des pores, la température élevée du procédé, la large distribution de la taille des pores et les coûts élevés du traitement. Jusqu'à présent, une recherche complète sur les échafaudages utilisés en génie tissulaire ayant des pores de taille significativement différente et contrôlée de manière précise au niveau microscopique tout en considérant l'infiltration de l'échafaudage comme un paramètre déterminant n'a pas encore été faite. Des échafaudages en PCL ayant les propriétés mentionnées précédemment ont été fabriqués par un mélange à l'état fondu avec du poly(oxyde d'éthylène) (PEO) choisi comme phase porogène. La composition du mélange a été choisie pour avoir une morphologie co-continue. Un recuit statique et une extraction sélective du PEO, qui est hydrosoluble, ont été effectués sur les mélanges ainsi obtenus. Les pores générés par cette méthode se sont avérés être entièrement interconnectés une propriété qui n'a pas été perturbée par le recuit. Le niveau d'interconnectivité des pores a été mesuré indirectement en déterminant le pourcentage de continuité de la phase porogène suite à l'extraction. Afin d'étudier l'effet de la taille des pores sur l'infiltration dans l'échafaudage, des structures en PCL ayant des diamètres moyens de pores de 84, 116, 141, et 162 micromètres ont été produits en faisant varier la durée du recuit. Pour cela, une nouvelle analyse in vitro a été utilisée pour comparer l'infiltration à travers l'échafaudage par des billes de polystyrène de 10 micromètres de diamètre ayant la même taille que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines et celle par des CSMs humaines. Le niveau de pénétration des billes à travers l'échafaudage a montré une augmentation linéaire avec la hausse de la taille de pores, tandis que les CSMs ne se sont infiltrées que dans les pores ayant une taille de 141 et 162 micromètres. Pour les tailles de pores inférieures, les cellules se sont agrégées et ont adhéré près de la zone d'ensemencement avec une basse infiltration dans la structure poreuse. Utiliser des billes sphériques non réactives a permis d'obtenir un point de référence pour les systèmes non-agrégés qui pourraient être considérés comme le scénario idéal pour l'infiltration. Ces résultats ont indiqué que les billes imitent étroitement les cellules pour des tailles de pores égales ou supérieures à 141 micromètres. Les tests de cytotoxicité utilisant des fibroblastes de souris L929 ont démontré que les échafaudages ne sont pas cytotoxiques et qu'ils n'induisent pas de nécrose lors du contact avec les cellules. Cependant, une légère diminution de l'activité métabolique des cellules a été observée, elle peut être attribuée à la surface hydrophobe du PCL. Par conséquent, la modification de la surface des échafaudages en PCL avec un agent cytocompatible et hydrophile peut fortement augmenter l'adhésion, la propagation et la différenciation des CSMs en ostéoblastes. Le chitosane, un composant important de la famille de polysaccharides, a été utilisé pour modifier la chimie des échafaudages de PCL en apportant l'hydrophilicité sur la surface. Le dépôt d'une couche homogène de chitosane sur la surface des échafaudages de PCL a été effectué à l'aide d'un autoassemblage couche-par-couche (LbL) de poly(chlorure de dialyldemethylammunium) (PDADMAC) comme polyélectrolyte cationique et de poly(styrenesulfonate de sodium 4) (PSS) comme polyélectrolyte anionique. La dernière couche de PSS négativement chargée permet l'addition du chitosane positivement chargé comme couche externe. Les mesures gravimétriques ont indiqué qu'une addition allant jusqu'à 3 couches a abouti à la formation de chaînes interpénétrées de polyélectrolyte qui ne permettent pas la formation de couches distinctes de charges positives ou négatives clairement définies. En augmentant le nombre de couches de polyélectrolytes chargés alternativement, des couches distinctes et mieux définies ont été formées. Les analyses détaillées des rapports d'O/C, de N/C et de S/C par la spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X (XPS), ont confirmé la présence dominante de la molécule de PSS à la surface, étant la dernière couche de polyélectrolyte déposée et en plus grand nombre de dépôts (n=8), qui pourra être plus tard la surface de déposition du chitosane. Il a alors été montré que la méthode de dépôt LbL a conduit à l'obtention d'une couche homogène de chitosane pour toutes les profondeurs de cavités dans les échafaudages. Cela confirme que la méthode de dépôt LbL est une meilleure stratégie que la méthode de revêtement par immersion. L'analyse au microscope électronique à balayage (MEB) a montré une surface rugueuse de chitosane sur les substrats 2D de PCL, dont l'épaisseur totale s'étend de 550-700 nanomètres. Ces résultats ont permis de vérifier que l'utilisation de l'autoassemblage couche-par-couche de polyélectrolytes suivie de l'addition de chitosane comme couche externe, a conduit à une modification stable et bien homogène de la surface. De plus, cette méthode a le potentiel de transformer un matériel classique en polymère synthétique avec des pores complètement interconnectés en un matériel ayant des caractéristiques de surface identiques à celles du chitosane. Le potentiel ostéogénique des échafaudages de PCL avec un traitement de surface par chitosane utilisant la méthode de dépôt LbL n'a jamais été évalué. Cette partie de la thèse considère l'hypothèse que l'ostéogenèse in vitro pourrait être réalisée dans les échafaudages 3D de PCL avec des pores interconnectés ayant un diamètre moyen de 84 et 141 micromètres, et que la biominéralisation pourrait être améliorée quand les pores sont revêtus avec du chitosane par l'approche LbL. Afin de réduire au minimum les erreurs provenant des inefficacités de l'infiltration cellulaire, le protocole le plus performant d'ensemencement des cellules a du être établi. Parmi l'ensemencement classique des cellules à 37 °C, l'ensemencement en deux étapes à 37°C, et l'ensemencement à froid à 4°C, dans un milieu contenant 2% de FBS (Fetal Bovine Serum), le dernier a montré la plus grande population de CSMs fraîchement trypsinisées dans toutes les profondeurs des échafaudages de 1 mm d'épaisseur. Les CSMs ensemencées dans des échafaudages de PCL, avec ou sans revêtement de chitosane par LbL, ont tout d'abord été mis en culture dans un milieu de prolifération pendant 10 jours, puis cultivées 21 jours dans un milieu ostéogénique. Au jour 2, les CSMs ont formé des monocouches creuses avec des morphologies cellulaires arrondies ayant de minces filopodes ancrés à la surface non modifiée du PCL, contrairement aux cellules étalées sur la surface des pores de PCL revêtue avec le chitosane. Au jour 10, les cellules ont proliféré formant une couche externe sur PCL et ont migré sur les réseaux de collagène sécrétés qui remplissent les espaces entre les pores dans tous les échafaudages, par contre, elles n'adhèrent qu'à des surfaces de pores revêtues par le chitosane. Au jour 31, des quantités équivalentes de tissu ont été observées dans les échafaudages avec et sans chitosane, cependant les dépôts de tissu ont été plus importants dans les pores externes que dans les pores internes. En outre, une plus grande quantité de matrice biominéralisée a été observée dans les pores internes des échantillons de 84 micromètres ayant un revêtement de chitosane. Dans les échantillons de PCL pur, le dépôt de minéraux a été observé de façon aléatoire dans les sections supérieures très colonisées et dans les pores internes de 141 micromètres de diamètre. Les CSMs cultivées sur la surface de contrôle 2D avec un revêtement de chitosane ont montré une coloration plus prononcée de la phosphatase alcaline, demeurant une minéralisation négligeable. Cette étude prouve que les CSMs survivent, se prolifèrent, et adhérent plutôt à la matrice fibreuse qu'à la surface non-modifiée des pores du PCL. De plus, les échafaudages revêtus par LbL-chitosane présentent plus de biominéralisation en 3D dans les pores internes de 84 micromètres; une réponse cellulaire qui peut être liée à la courbure de la surface ainsi qu'à l'amélioration de l'hydrophilicité de la surface.

Abstract

The application of porous three-dimensional scaffolds seeded with osteoprogenitor cells such as human mesenchymal stem cells (hBMSC) for bone regeneration has become a promising tool for in vitro bone tissue engineering. Scaffolds in bone tissue engineering act as a supportive bridge that facilitates the migration, attachment and distribution of the host cells involved in bone ingrowth. These porous structures should be biocompatible, biodegradable and ideally exhibit a favorable surface chemistry, controlled interconnected pores, pore sizes and narrow pore size distributions. Among a variety of synthetic and natural materials suggested for bone tissue engineering, poly(ε-caprolactone) (PCL) has been widely used for this purpose, owing to its biocompatibility, low immunogenicity, slow biodegradation and mechanical stability for up to three years in vivo. Various fabrication techniques have been used for the production of bone tissue engineering scaffolds, such as sintering, solvent casting and particulate leaching, gas foaming and rapid prototyping. These methods are normally associated with numerous drawbacks such as the use of toxic solvents, limitations imposed by the shape of the porogen phase, low levels of pore interconnectivity, high processing temperatures, large pore size distributions and high processing costs. To date, a thorough investigation of tissue engineering scaffolds of significantly different and highly controlled pore sizes at the microscopic level including scaffold infiltration as a crucial parameter has not been done. PCL scaffolds with the features mentioned above have been fabricated by melt blending of PCL with poly(ethylene oxide) (PEO) at co-continuous composition followed by static annealing of the blends and selective extraction of water soluble PEO as the porogen phase. The pores generated by this method were proved to be fully interconnected- a property which was not disrupted by annealing. The level of pore interconnectivity was measured indirectly by determining the continuity % of the porogen phase post-extraction. PCL scaffolds with 84, 116, 141, and 162 μm average diameter pore sizes have been generated by varying the annealing time to investigate the effect of pore size on the scaffold infiltration. For this purpose, a novel in vitro assay was used to compare scaffold infiltration by 10-micron diameter polystyrene beads and trypsinized human bone marrow stromal cells (hBMSCs). Beads showed a linear increase in the extent of scaffold infiltration with increasing pore size. BMSCs infiltrated the 162 and 141 μm pore samples, below which the cells aggregated and adhered near the seeding area with low infiltration into the porous device. Using non-interacting spherical beads provides a base-line for non-aggregated systems which could be considered as the ideal infiltration scenario. These results revealed that the beads closely mimic the cells at pore sizes equal and higher than 141 μm. Cytotoxicity studies using L929 mouse fibroblasts demonstrated that the scaffolds are not cytotoxic and do not induce necrosis upon contact with the cells. However, a slight decrease in the metabolic activity of the cells was observed which was attributed to the hydrophobic surface of PCL. Hence, the surface modification of PCL scaffolds with a hydrophilic cytocompatible agent could potentially enhance cell attachment, spreading and differentiation of hBMSCs into osteoblasts. Chitosan, an important member of the polysaccharide family was used to alter the chemistry of PCL scaffolds and bring hydrophilicity to the surface. The deposition of a homogeneous chitosan layer on the surface of the PCL scaffolds was carried out using a Layer-by-Layer (LbL) self-assembly of poly(dialyldemethylammunium chloride) (PDADMAC) as cationic and poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS) as anionic polyelectrolytes. The final negatively charged PSS layer allows for the addition of the positively charged chitosan as the outermost layer. Gravimetric measurements revealed that the addition of up to 3 layers leads to the formation of interdiffusing polyelectrolyte layers which do not allow for the formation of defined positive or negative charges. By increasing the number of polyelectrolyte layers with alternating charges, more well-defined layers are formed. Detailed analyses of O/C, N/C and S/C ratios by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) show that the PSS molecule dominates the surface as the last deposited polyelectrolyte layer at higher number of depositions (n=8), which can later be the surface for the deposition of chitosan. The LbL deposition of the chitosan layer on the LbL coating was then shown to be locally homogeneous at different depths within the scaffolds which also clarified that the LbL method is superior to the dip coating strategy. SEM analysis showed that there is a rough chitosan surface on the 2D solid PCL constructs whose thickness ranges from 550-700 nanometers. These results demonstrate that the application of LbL self-assembly of polyelectrolytes followed by the addition of chitosan as the outermost layer provides a route towards stable and homogeneous surface modification and has the potential to transform a classic fully interconnected porous synthetic polymer material to one with essentially complete chitosan-like surface characteristics. The osteogenic potential of PCL scaffolds with a chitosan coating using Layer-by-Layer (LbL) surface modification has never been evaluated before. This part of the study tests the hypothesis that in vitro osteogenesis can be achieved in 3D PCL scaffolds with fully interconnected pores of 84 μm or 141 μm average diameter and biomineralization can be enhanced when pore surfaces are coated with chitosan adsorbed to LbL deposited polyelectrolytes. In order to reduce the errors originating from cell infiltration inefficiencies, the most competent cell seeding protocol has to be defined. Among classical cell seeding at 37°C, 2-step seeding at 37°C and cold seeding at 4°C in a medium containing 2% FBS, the last strategy proved to yield the best population of freshly trypsinized hBMSCs at all depths of the 1mm-thick scaffolds. hBMSCs cold-seeded in PCL scaffolds with or without an LbL-chitosan coating were cultured for 10 days in proliferation medium, followed by 21 days in osteogenic medium. At day 2, MSCs formed sparse monolayers with rounded cell morphologies with thin filopodia anchored to the unmodified PCL, as compared to more spread cells on chitosan-coated pore surfaces. At day 10, cells proliferated as an external layer, and migrated onto secreted collagen networks that filled the interpore spaces of all scaffolds, but only adhered to chitosan-coated pore surfaces. At day 31, similar levels of tissue formed in scaffolds with and without chitosan, but more tissue was deposited in the outer pores than the inner pores. Furthermore, more biomineralized matrix was observed in the inner 84 μm chitosan-coated pores (p<0.05). In the PCL-only samples, haphazard mineral deposits were observed in highly colonized outer layers and in the inner 141 μm pores. MSCs cultured on chitosan-coated 2D control surfaces show higher alkaline phosphatase staining but negligible mineralization. This study showed that hBMSCs survive, proliferate, and attach to fibrotic matrix rather than the PCL-only scaffold pore surfaces. LbL-chitosan-coated scaffolds showed more biomineralization in 3D inner 84 μm pores, a cell response that may be related to surface curvature in addition to improved surface hydrophilicity.