Détermination de la toxicité à long-terme du zinc sur la diversité fonctionnelle enzymatique de sols contaminés collectés sur le terrain

L'évaluation de l'impact potentiel écotoxique des métaux en analyse de cycle de vie (ACV) repose sur des données générées lors de tests de toxicité en laboratoire et archivées dans des banques de données spécialisées en écotoxicologie. Or, peu de données sont disponibles pour les écosystèmes terrestres et celles-ci sont généralement issues de tests sur les plantes ou les invertébrés du sol, ce qui ne couvre pas assez de catégories d'organismes pour bien représenter l'écosystème. De plus, les données disponibles sont souvent inadaptées au contexte de contamination métallique et sont généralement obtenues sur des sols artificiellement contaminés en laboratoire. Par conséquent, l'impact écotoxique potentiel des métaux en ACV est mal modélisé et non représentatif des contaminations réelles. Il faut donc générer rapidement des données écotoxiques qui tiennent compte des particularités d'une contamination métallique et qui proviennent d'une autre catégorie d'organismes terrestres peu représentée en écotoxicologie. La communauté microbienne terrestre présente ainsi plusieurs atouts puisqu'elle est en contact direct avec le sol et qu'elle est indigène. De tous les indicateurs microbiens existants, l'évaluation des réponses enzymatiques du sol est une avenue intéressante puisque les enzymes sont à la base des processus métaboliques et des cycles biogéochimiques des organismes vivants, elles sont produites principalement par la communauté microbienne et elles sont sensibles aux métaux. De plus, l'agrégation des réponses de plusieurs enzymes du sol pourrait conduire à un indice de diversité fonctionnelle (DF) enzymatique, un attribut de pertinence écologique de plus en plus encouragé dans les études des services écosystémiques. Cependant, dans le contexte d'une contamination métallique de terrain, la communauté microbienne peut développer des mécanismes de tolérance (adaptation génétique ou acclimatation physiologique) rendant l'activité enzymatique apparente des sols contaminés non corrélée au métal. Dans ce cas particulier, il faut trouver une autre approche écotoxicologique pour évaluer les réponses enzymatiques des sols contaminés par les métaux collectés sur le terrain. La stabilité enzymatique des sols, basée sur la dynamique de récupération de l'activité enzymatique suite à une perturbation contrôlée en laboratoire, est une approche de plus en plus promue en écologie microbienne et pourrait être plus sensible aux métaux que l'approche classique basée sur l'activité enzymatique. Il faut donc étudier ces deux approches enzymatiques (activité vs stabilité) pour voir celle qui est la plus adaptée au contexte du projet. Le métal testé pour ce projet est le zinc (Zn). L'objectif principal du projet porte sur le développement d'une méthodologie écotoxicologique basée sur la diversité fonctionnelle enzymatique agrégée et sensible à la concentration de Zn dans des sols contaminés collectés sur le terrain. Les objectifs spécifiques sont: 1) Sélectionner la solution d'incubation assurant des résultats enzymatiques justes et optimaux dans le contexte d'une contamination métallique 2) Élaborer un score de stabilité enzymatique qui tient compte des particularités physico-chimiques propres à chaque site échantillonné tout en étant sensible au Zn et 3) Générer une donnée écotoxique à partir d'un indice de diversité fonctionnelle enzymatique agrégé (activité ou stabilité) bien corrélé (R2  0,50) au Zn de sols contaminés. SOLUTION D'INCUBATION DES ESSAIS ENZYMATIQUES Le premier objectif spécifique du projet consistait à s'assurer que les essais enzymatiques génèrent des résultats représentatifs de ceux observés sur le terrain (in situ) et à vérifier si l'eau peut substituer l'utilisation de solutions tampon. Cette section a conduit à la rédaction du premier manuscrit intitulé “ Metal toxicity assessment in soils using enzymatic activity : Can water be used as surrogate buffer? ˮ et publié dans la revue Soil Biology & Biochemistry (chapitre 3). En effet, dû à l'effet ubiquitaire du pH sur 1'activité enzymatique, la composition de la solution de sol et la spéciation des métaux, il fallait préliminairement s'assurer que la solution d'incubation utilisée ne modifie pas la toxicité in situ du Zn des sols collectés sur le terrain et qu'elle n'entraine pas de fluctuation de pH durant les essais. Trois étapes allaient répondre à ce but : 1) Quantifier le Zn labile (une forme biodisponible) des échantillons du sol après contact avec différentes solutions d'incubation utilisées dans les essais enzymatiques (différents tampons et eau), 2) Mesurer à intervalles réguliers le pH des échantillons durant les essais enzymatiques conduits dans l'eau et 3) Comparer les essais conduits de façon standard dans un tampon à ceux conduits en parallèle dans de l'eau. Les résultats de cet objectif sont présemtés dans le chapitre 3 et la section 6.1. Ils ont montré qu'une seule solution d'incubation, le tampon acétate pH 5,8 utilisé dans les essais standards de l'arylsulfatase, augmentait considérablement la concentration du Zn labile après 2 h de contact, temps correspondant à la durée des essais enzymatiques. Cependant, même si cette concentration est 10 à 50 fois plus élevée que celle mesurée dans l'eau ou les autres tampons, elle n'affecte pas l'activité de l'arylsulfatase à court terme (2 h) puisque l'activité de l'arylsulfatase dans le tampon acétate est très similaire à son activité dans l'eau. De plus, le pH des échantillons mis en contact avec de l'eau n'a pas significativement fluctué comparativement au pH des échantillons mis en contact avec le tampon usuel. Finalement, l'activité enzymatique obtenue en utilisant le tampon est généralement bien corrélée (c.-à-d. R2 élevé) à celle obtenue en utilisant de l'eau à l'exception de deux enzymes, l'uréase et la phosphatase alcaline, utilisant des tampons standards à pH alcalins (pH 10 et pH 11 respectivement). Par conséquent, l'utilisation de l'eau comme substitut aux tampons est justifiée, non pas parce que les tampons modifient la biodisponibilité du Zn et ainsi sa toxicité, mais plutôt parce que des conditions d'incubation standards loin des conditions réelles de terrain engendrent des résultats incertains et, qui plus est, non optimaux. SCORE DE STABILITÉ ENZYMATIQUE ADAPTÉ AU CONTEXTE MÉTALLIQUE Le deuxième objectif spécifique du projet consistait à cibler le score de stabilité enzymatique (SE) le plus sensible à une contamination réelle au Zn sur le terrain et a conduit à la rédaction du deuxième manuscrit intitulé “ Linking Zn co-tolerance to soil enzymes resilience by a RSSI-based functional stability score ˮ et soumis dans la revue FEMS Microbiology Ecology (chapitre 4). Une méthode SE intéressante était la méthode RSSI (Relative Soil Stability Index), car elle est la première à avoir considéré la dynamique de la récupération à l'intérieur de son score et elle est basée sur l'activité enzymatique du sol. Mais d'abord, il fallait modifier le score original RSSI pour y intégrer l'historique physico-chimique du site échantillonné car il s'agissait d'une lacune majeure du score original. Trois nouveaux scores ont ainsi été développés. Ici aussi, trois étapes allaient répondre à l'objectif spécifique de cette partie : 1) Normaliser le score RSSI par le sol de référence, perturbé ou non, 2) Déterminer le score SE le plus sensible au Zn en corrélant ces nouveaux scores et ceux déjà existants aux concentrations de Zn des sols et 3) Faire une analyse multivariée pour vérifier quelles propriétés physico-chimiques influencent le score SE sélectionné. Les résultats de cette partie sont présentés dans le chapitre 4. Le meilleur score SE est un des nouveaux scores intégrant l'historique du site d'échantillonnage, soit le RSSIb. Ce score a détecté la toxicité du Zn sur trois enzymes individuelles (arylsulfatase, protéase et uréase) alors que les autres scores n'ont détecté la toxicité du Zn que sur une enzyme (variable selon le score). Les concentrations biodisponibles de Zn (labile et soluble) ont généré les plus fortes régressions, alors que la concentration totale de Zn n'était pas bien corrélée au RSSIb. Les résultats statistiques ont montré que le score RSSIb était fortement corrélé (négativement) à la concentration de Zn labile (et de façon moindre à la concentration de Zn soluble) du sol et que la texture et le pH étaient modérément corrélés au RSSIb. Les autres propriétés (concentration de carbone organique total ou dissout, capacité tampon, capacité d'échange cationique et concentration total de Zn) ont très peu influencé la SE du sol évaluée par le score RSSIb. La SE du sol évaluée par le score RSSIb est donc un bon indicateur de toxicité du Zn des sols contaminés, car le RSSIb dépend principalement du contenu en Zn biodisponible du sol. INDICE DE DIVERSITÉ FONCTIONNELLE ENZYMATIQUE Le troisième objectif spécifique du projet consistait à développer un indice de diversité fonctionnelle enzymatique sensible au Zn et a conduit à la rédaction du troisième manuscrit intitulé “ Toxicity response of a new enzyme-based functional diversity methodology for Zn contaminated field-collected soils ˮ et soumis dans la revue Soil Biology & Biochemistry (chapitre 5). Parallèlement, il fallait vérifier quelle approche, l'activité enzymatique classique ou la stabilité enzymatique évaluée par le score RSSIb agrégé, était la plus sensible au Zn et la plus judicieuse d'un point de vue pratique. Quatre étapes allaient répondre à l'objectif spécifique de cette partie : 1) Développer un indice de diversité fonctionnelle statistiquement valide basé sur l'agrégation de résultats enzymatiques (activité et stabilité) 2) Calculer les indices de DF ciblés pour chaque sol contaminé au Zn et pour chacune des deux approches enzymatiques 3) Corréler ces indices de DF aux différentes concentrations de Zn des sols afin de générer une donnée écotoxique et 4) Comparer les données et les paramètres de régression obtenus par les 2 approches enzymatiques et identifier celle qui est la plus pertinente pour évaluer la DF. La démarche d'agrégation utilisée a été validée statistiquement par une analyse en composantes principales montrant qu'au moins 75% de la variabilité enzymatique pouvait être expliquée par la première composante principale, justifiant ainsi l'agrégation de ces 6 variables (réponses enzymatiques) en un seul indice DF. Plusieurs indices DF ont été testés, mais ce sont les moyennes pondérée et géométrique des résultats enzymatiques qui se sont avérées les plus fiables comparativement aux autres indices (Shannon, Simpson et Gini). De plus, la diversité fonctionnelle enzymatique des sols contaminés par le Zn s'est montrée sensible à un gradient de Zn biodisponible (soluble et labile). Finalement, l'activité enzymatique agrégée demeure aussi bien corrélée à un gradient de Zn soluble ou labile que la stabilité enzymatique agrégée et ce, même après plusieurs années d'exposition. Ainsi, bien que l'utilisation du concept de stabilité enzymatique ait été judicieuse et réfléchie, elle n'a pas apporté de valeur ajoutée à l'évaluation de la toxicité du Zn par l'agrégation des résultats enzymatiques. CONCLUSION Globalement, la thèse a permis de définir les bases d'une méthodologie d'évaluation de toxicité terrestre in situ adaptée à une contamination de Zn à long terme et basée sur la diversité fonctionnelle enzymatique, un attribut de pertinence écologique très promu. Cette méthodologie pourrait être utilisée pour d'autres contaminants métalliques de sorte à générer d'autres données écotoxiques afin d'ultimement améliorer la modélisation de l'impact potentiel toxique des métaux en ACV.