Détermination de la toxicité à long-terme du zinc sur la diversité fonctionnelle enzymatique de sols contaminés collectés sur le terrain

L'évaluation de l'impact potentiel écotoxique des métaux en analyse de cycle de vie (ACV) repose sur des données générées lors de tests de toxicité en laboratoire et archivées dans des banques de données spécialisées en écotoxicologie. Or, peu de données sont disponibles pour les écosystèmes terrestres et celles-ci sont généralement issues de tests sur les plantes ou les invertébrés du sol, ce qui ne couvre pas assez de catégories d'organismes pour bien représenter l'écosystème. De plus, les données disponibles sont souvent inadaptées au contexte de contamination métallique et sont généralement obtenues sur des sols artificiellement contaminés en laboratoire. Par conséquent, l'impact écotoxique potentiel des métaux en ACV est mal modélisé et non représentatif des contaminations réelles. Il faut donc générer rapidement des données écotoxiques qui tiennent compte des particularités d'une contamination métallique et qui proviennent d'une autre catégorie d'organismes terrestres peu représentée en écotoxicologie. La communauté microbienne terrestre présente ainsi plusieurs atouts puisqu'elle est en contact direct avec le sol et qu'elle est indigène. De tous les indicateurs microbiens existants, l'évaluation des réponses enzymatiques du sol est une avenue intéressante puisque les enzymes sont à la base des processus métaboliques et des cycles biogéochimiques des organismes vivants, elles sont produites principalement par la communauté microbienne et elles sont sensibles aux métaux. De plus, l'agrégation des réponses de plusieurs enzymes du sol pourrait conduire à un indice de diversité fonctionnelle (DF) enzymatique, un attribut de pertinence écologique de plus en plus encouragé dans les études des services écosystémiques. Cependant, dans le contexte d'une contamination métallique de terrain, la communauté microbienne peut développer des mécanismes de tolérance (adaptation génétique ou acclimatation physiologique) rendant l'activité enzymatique apparente des sols contaminés non corrélée au métal. Dans ce cas particulier, il faut trouver une autre approche écotoxicologique pour évaluer les réponses enzymatiques des sols contaminés par les métaux collectés sur le terrain. La stabilité enzymatique des sols, basée sur la dynamique de récupération de l'activité enzymatique suite à une perturbation contrôlée en laboratoire, est une approche de plus en plus promue en écologie microbienne et pourrait être plus sensible aux métaux que l'approche classique basée sur l'activité enzymatique. Il faut donc étudier ces deux approches enzymatiques (activité vs stabilité) pour voir celle qui est la plus adaptée au contexte du projet. Le métal testé pour ce projet est le zinc (Zn). L'objectif principal du projet porte sur le développement d'une méthodologie écotoxicologique basée sur la diversité fonctionnelle enzymatique agrégée et sensible à la concentration de Zn dans des sols contaminés collectés sur le terrain. Les objectifs spécifiques sont: 1) Sélectionner la solution d'incubation assurant des résultats enzymatiques justes et optimaux dans le contexte d'une contamination métallique 2) Élaborer un score de stabilité enzymatique qui tient compte des particularités physico-chimiques propres à chaque site échantillonné tout en étant sensible au Zn et 3) Générer une donnée écotoxique à partir d'un indice de diversité fonctionnelle enzymatique agrégé (activité ou stabilité) bien corrélé (R2  0,50) au Zn de sols contaminés. SOLUTION D'INCUBATION DES ESSAIS ENZYMATIQUES Le premier objectif spécifique du projet consistait à s'assurer que les essais enzymatiques génèrent des résultats représentatifs de ceux observés sur le terrain (in situ) et à vérifier si l'eau peut substituer l'utilisation de solutions tampon. Cette section a conduit à la rédaction du premier manuscrit intitulé “ Metal toxicity assessment in soils using enzymatic activity : Can water be used as surrogate buffer? ˮ et publié dans la revue Soil Biology & Biochemistry (chapitre 3). En effet, dû à l'effet ubiquitaire du pH sur 1'activité enzymatique, la composition de la solution de sol et la spéciation des métaux, il fallait préliminairement s'assurer que la solution d'incubation utilisée ne modifie pas la toxicité in situ du Zn des sols collectés sur le terrain et qu'elle n'entraine pas de fluctuation de pH durant les essais. Trois étapes allaient répondre à ce but : 1) Quantifier le Zn labile (une forme biodisponible) des échantillons du sol après contact avec différentes solutions d'incubation utilisées dans les essais enzymatiques (différents tampons et eau), 2) Mesurer à intervalles réguliers le pH des échantillons durant les essais enzymatiques conduits dans l'eau et 3) Comparer les essais conduits de façon standard dans un tampon à ceux conduits en parallèle dans de l'eau. Les résultats de cet objectif sont présemtés dans le chapitre 3 et la section 6.1. Ils ont montré qu'une seule solution d'incubation, le tampon acétate pH 5,8 utilisé dans les essais standards de l'arylsulfatase, augmentait considérablement la concentration du Zn labile après 2 h de contact, temps correspondant à la durée des essais enzymatiques. Cependant, même si cette concentration est 10 à 50 fois plus élevée que celle mesurée dans l'eau ou les autres tampons, elle n'affecte pas l'activité de l'arylsulfatase à court terme (2 h) puisque l'activité de l'arylsulfatase dans le tampon acétate est très similaire à son activité dans l'eau. De plus, le pH des échantillons mis en contact avec de l'eau n'a pas significativement fluctué comparativement au pH des échantillons mis en contact avec le tampon usuel. Finalement, l'activité enzymatique obtenue en utilisant le tampon est généralement bien corrélée (c.-à-d. R2 élevé) à celle obtenue en utilisant de l'eau à l'exception de deux enzymes, l'uréase et la phosphatase alcaline, utilisant des tampons standards à pH alcalins (pH 10 et pH 11 respectivement). Par conséquent, l'utilisation de l'eau comme substitut aux tampons est justifiée, non pas parce que les tampons modifient la biodisponibilité du Zn et ainsi sa toxicité, mais plutôt parce que des conditions d'incubation standards loin des conditions réelles de terrain engendrent des résultats incertains et, qui plus est, non optimaux. SCORE DE STABILITÉ ENZYMATIQUE ADAPTÉ AU CONTEXTE MÉTALLIQUE Le deuxième objectif spécifique du projet consistait à cibler le score de stabilité enzymatique (SE) le plus sensible à une contamination réelle au Zn sur le terrain et a conduit à la rédaction du deuxième manuscrit intitulé “ Linking Zn co-tolerance to soil enzymes resilience by a RSSI-based functional stability score ˮ et soumis dans la revue FEMS Microbiology Ecology (chapitre 4). Une méthode SE intéressante était la méthode RSSI (Relative Soil Stability Index), car elle est la première à avoir considéré la dynamique de la récupération à l'intérieur de son score et elle est basée sur l'activité enzymatique du sol. Mais d'abord, il fallait modifier le score original RSSI pour y intégrer l'historique physico-chimique du site échantillonné car il s'agissait d'une lacune majeure du score original. Trois nouveaux scores ont ainsi été développés. Ici aussi, trois étapes allaient répondre à l'objectif spécifique de cette partie : 1) Normaliser le score RSSI par le sol de référence, perturbé ou non, 2) Déterminer le score SE le plus sensible au Zn en corrélant ces nouveaux scores et ceux déjà existants aux concentrations de Zn des sols et 3) Faire une analyse multivariée pour vérifier quelles propriétés physico-chimiques influencent le score SE sélectionné. Les résultats de cette partie sont présentés dans le chapitre 4. Le meilleur score SE est un des nouveaux scores intégrant l'historique du site d'échantillonnage, soit le RSSIb. Ce score a détecté la toxicité du Zn sur trois enzymes individuelles (arylsulfatase, protéase et uréase) alors que les autres scores n'ont détecté la toxicité du Zn que sur une enzyme (variable selon le score). Les concentrations biodisponibles de Zn (labile et soluble) ont généré les plus fortes régressions, alors que la concentration totale de Zn n'était pas bien corrélée au RSSIb. Les résultats statistiques ont montré que le score RSSIb était fortement corrélé (négativement) à la concentration de Zn labile (et de façon moindre à la concentration de Zn soluble) du sol et que la texture et le pH étaient modérément corrélés au RSSIb. Les autres propriétés (concentration de carbone organique total ou dissout, capacité tampon, capacité d'échange cationique et concentration total de Zn) ont très peu influencé la SE du sol évaluée par le score RSSIb. La SE du sol évaluée par le score RSSIb est donc un bon indicateur de toxicité du Zn des sols contaminés, car le RSSIb dépend principalement du contenu en Zn biodisponible du sol. INDICE DE DIVERSITÉ FONCTIONNELLE ENZYMATIQUE Le troisième objectif spécifique du projet consistait à développer un indice de diversité fonctionnelle enzymatique sensible au Zn et a conduit à la rédaction du troisième manuscrit intitulé “ Toxicity response of a new enzyme-based functional diversity methodology for Zn contaminated field-collected soils ˮ et soumis dans la revue Soil Biology & Biochemistry (chapitre 5). Parallèlement, il fallait vérifier quelle approche, l'activité enzymatique classique ou la stabilité enzymatique évaluée par le score RSSIb agrégé, était la plus sensible au Zn et la plus judicieuse d'un point de vue pratique. Quatre étapes allaient répondre à l'objectif spécifique de cette partie : 1) Développer un indice de diversité fonctionnelle statistiquement valide basé sur l'agrégation de résultats enzymatiques (activité et stabilité) 2) Calculer les indices de DF ciblés pour chaque sol contaminé au Zn et pour chacune des deux approches enzymatiques 3) Corréler ces indices de DF aux différentes concentrations de Zn des sols afin de générer une donnée écotoxique et 4) Comparer les données et les paramètres de régression obtenus par les 2 approches enzymatiques et identifier celle qui est la plus pertinente pour évaluer la DF. La démarche d'agrégation utilisée a été validée statistiquement par une analyse en composantes principales montrant qu'au moins 75% de la variabilité enzymatique pouvait être expliquée par la première composante principale, justifiant ainsi l'agrégation de ces 6 variables (réponses enzymatiques) en un seul indice DF. Plusieurs indices DF ont été testés, mais ce sont les moyennes pondérée et géométrique des résultats enzymatiques qui se sont avérées les plus fiables comparativement aux autres indices (Shannon, Simpson et Gini). De plus, la diversité fonctionnelle enzymatique des sols contaminés par le Zn s'est montrée sensible à un gradient de Zn biodisponible (soluble et labile). Finalement, l'activité enzymatique agrégée demeure aussi bien corrélée à un gradient de Zn soluble ou labile que la stabilité enzymatique agrégée et ce, même après plusieurs années d'exposition. Ainsi, bien que l'utilisation du concept de stabilité enzymatique ait été judicieuse et réfléchie, elle n'a pas apporté de valeur ajoutée à l'évaluation de la toxicité du Zn par l'agrégation des résultats enzymatiques. CONCLUSION Globalement, la thèse a permis de définir les bases d'une méthodologie d'évaluation de toxicité terrestre in situ adaptée à une contamination de Zn à long terme et basée sur la diversité fonctionnelle enzymatique, un attribut de pertinence écologique très promu. Cette méthodologie pourrait être utilisée pour d'autres contaminants métalliques de sorte à générer d'autres données écotoxiques afin d'ultimement améliorer la modélisation de l'impact potentiel toxique des métaux en ACV.

Abstract

INTRODUCTION The potential ecotoxic impact assessment of metals in life cycle assessment (LCA) requires data generated from ecotoxicological tests and recorded in specialized databases. However, there is a lack of available terrestrial data and when available, it is mainly obtained from plants and soil invertebrates, which is insufficient to adequately represent the terrestrial ecosystem. Moreover, the available data are not adapted to a metallic contamination context and are generated from tests conducted on laboratory-spiked soils instead of field-contaminated soils. Therefore, modeling the potential toxic impact of metals raises several issues and highlights the pressing need to generate more representative data from a category of terrestrial organisms rarely used in ecotoxicology. The soil microbial community shows many advantages in this context since it is in direct and complete contact with soil and it is indigenous. Among existing microbial indicators, soil enzymatic activity is particularly interesting since enzymes are pre-requisites of metabolic pathways and biogeochemical cycles, are mainly produced by the soil microorganisms and are metal-sensitive. Furthermore, the aggregation of enzymatic responses of many soil enzymes could lead to a functional diversity (FD) index, which is an attribute of ecological relevance increasingly promoted for studying ecosystemic services. However, in a metal field contamination context, the microbial community may develop tolerance mechanisms by genetic adaptation or physiological acclimation, yielding apparent soil enzymatic activity uncorrelated to metal concentrations. In this case, it is necessary to find an alternative approach to assess the enzymatic responses to metal contamination. The enzymatic stability, based on the resilience dynamic of the enzymatic activity after a laboratory-controlled disturbance, is an approach increasingly encouraged in microbial ecology and may be more metal sensitive than the traditional enzymatic activity approach. These two approaches need to be studied in order to establish which is the most adapted for the study of metal-contaminated field soil. Zinc was selected for this project. The aim of this project is to develop a long-term, Zn-sensitive, ecotoxicological methodology based on the aggregated enzymatic functional diversity in field-contaminated soils. The specific objectives are to: 1) Select the incubation solution ensuring optimal and accurate enzymatic results in a metallic contamination context; 2) Elaborate an enzymatic stability score which takes into account the physicochemical history of the sampled site and which is Zn-sensitive and; 3) Generate new ecotoxicological data from an aggregated enzymatic functional diversity (activity or stability) which is well-correlated (i.e. R2 > 0.50) to Zn concentrations of field-contaminated soils. INCUBATION SOLUTION FOR ENZYMATIC ASSAYS The first specific objective of the project was to validate that the enzymatic assays generate representative results from those observed on the field and verify whether water could substitute the buffer in an incubation solution. This section led to the first manuscript (chapter 3), which has been accepted in the Soil Biology & Biochemistry journal. Due to the pH affecting simultaneously the enzymatic activity, the metal speciation and the soil solution composition, it was necessary to ensure that the incubation solution did not modify the in situ Zn toxicity of field soils and that the pH remained stable during the enzymatic assays. Three main steps were required to reach this objective: 1) Measure the labile Zn concentration of soil samples in contact with different incubation solutions used for enzymatic assays (buffers and water); 2) Measure at regular intervals sample pH of enzymatic assays conducted in water and; 3) Compare the enzymatic assays conducted in buffer to those conducted in water. The results of this objective are recorded in chapter 3. They showed that only one incubation solution, the acetate buffer pH 5.8 used in the standard enzymatic assays related to arylsulfatase, considerably increased the labile Zn concentration after a contact time of 2 h, corresponding to the incubation time of the enzymatic assays. However, although this concentration was 10 to 50 times higher than the one measured in water or the other buffers, it did not affect the short-term response of arylsulfatase since its activity conducted in its buffer was similar to its activity conducted in water. Additionally, the pH of enzymatic samples conducted in water did not significantly fluctuate compared to the pH of those conducted in buffers. Finally, the enzymatic assays conducted in water were well-correlated (i.e. R2 > 0.80) to those conducted in buffers, except for two enzymes, urease and alkaline phosphatase, which both used buffers at pH 10 and pH 11 respectively. Therefore, water may be used as a surrogate incubation solution, not because the buffers modify the metal speciation and toxicity but rather because standard incubation pH, which is far from pH observed in field soils, generates uncertain and non-optimal enzymatic results. ENZYMATIC STABILITY SCORE ADAPTED TO A METALLIC CONTAMINATION The second specific objective of this project was to select the most Zn-sensitive enzymatic stability (ES) score and led to the second manuscript (chapter 4) submitted to the FEMS Microbiology Ecology journal. One interesting ES method is known as the Relative soil stability index (RSSI) method. It was the first enzyme-based method to take into account the resilience dynamic within the ES score. The method first needed to be modified in order to include the physicochemical history of the sampled site. Thus, three new RSSI-based ES scores were created. Three main steps were required to reach this objective: 1) Normalize the RSSI score by its reference soil, disturbed or not; 2) Determine the most Zn-sensitive ES score by correlating the ES scores (new and old) to the soil Zn concentrations and; 3) Perform a multivariate analysis in order to verify which soil physicochemical properties affect the ES. The results related to this objective are shown in chapter 4. The best ES score obtained is one of the new scores which include the physicochemical history of the sampled site, i.e. the RSSIb score. This score detected the Zn toxicity on three individual enzymes (arylsulfatase, protease and urease) whereas other ES scores detected the Zn toxicity for only one enzyme, which varied depending on the score. The labile Zn concentration generated the highest R2, although the soluble Zn concentration was also well correlated to the RSSIb. The total Zn concentration was a poor predictor of Zn toxicity. The statistical results also showed that texture and pH were moderately correlated to the RSSIb, whereas other properties (total and dissolved organic carbon, cationic exchange capacity and buffer capacity) poorly affected the RSSIb score. The ES assessment by the RSSIb score is a suitable ecotoxicological indicator of Zn in contaminated field soil, since this score almost solely depends on the bioavailable Zn fraction of soils. ENZYMATIC FUNCTIONAL DIVERSITY INDEX The third specific objective was to develop a Zn-sensitive enzymatic functional diversity index and led to the third manuscript (chapter 5) submitted in the Soil Biology & Biochemistry journal. Alongside this objective, the most Zn-sensitive and judicious practical enzymatic approach between traditional activity or stability needed to be elucidate. Four steps were required to reach this objective: 1) Develop a statistically valid functional diversity index based on the aggregated enzymatic results (activity and stability); 2) Calculate the selected FD indexes for every Zn-contaminated field soil and every enzymatic approach; 3) Correlate these FD indexes with the Zn concentrations in order to generate ecotoxicological data and; 4) Compare the regression parameters and identify the most relevant enzymatic approach. The enzymatic aggregation was statistically validated by a principal component analysis showing that at least 75% of the enzymatic variability could be explained by the main component, which justified the aggregation of the 6 variables (enzymatic responses) in one FD index. Many FD indexes were tested, but the weighted and geometric means better assessed the Zn toxicity than other indexes such as the Shannon, Simpson or Gini index. The enzymatic FD indexes based on means were similarly sensitive to soluble and labile Zn concentrations, but not to the total Zn concentration. Moreover, the traditional enzymatic activity approach remained as Zn-sensitive as the enzymatic stability approach even after many years of metal exposition. This entails that, although the idea of using the ES approach was thoughtful and judicious, this approach did not provide any added value for the Zn toxicity assessment by aggregated enzymatic results. CONCLUSION Globally, this thesis defines the basis of a new in situ methodology for the long-term terrestrial ecotoxicity of Zn, based on the enzymatic functional diversity, an increasingly promoted attribute of ecological relevance. This methodology could be used for other metals in order to generate more ecotoxicological data and ultimately improve the potential ecotoxic impact modeling of metals in LCA.