Comprehensive Characterization of an Inducible Mammalian Expression System Using 13C-Metabolic Flux Analysis

La culture de cellules de mammifères constitue à ce jour la plateforme d'expression la plus utilisée dans l'industrie biopharmaceutique, en raison de la capacité inégalée de ces cellules à réaliser les modifications post-traductionnelles essentielles à la fonctionnalité des produits complexes. En raison de la forte demande pour les produits biothérapeutiques, de la volonté de diminuer les coûts associés au développement des bioprocédés et du besoin de réduire les temps de mise en marché, plusieurs progrès réalisés au cours des dernières décennies ont permis des améliorations significative en termes de rendement et de qualité du produit. Ces avancées ont été effectuées surtout grâce au développement de meilleurs vecteurs d'expression, au développement de milieux de culture plus performants et à l'application de stratégies fed-batch permettant l'atteinte de très hautes densités cellulaires. Une autre avancée récente concerne le développement de systèmes d'expression inductibles, dont l'énorme avantage est de permettre de découpler les phases de croissance et de production, conférant ainsi la possibilité d'optimiser chacune des phases indépendamment, avec des conditions opératoires spécifiques à chacune d'elles. Par ailleurs, cela permet en principe de faire croître les cellules plus rapidement avant la phase d'induction, puisque ces dernières n'ont pas à supporter la charge métabolique additionnelle qu'impose la synthèse d'une protéine recombinante. Dans de tels procédés bi-phasiques, établir le moment propice pour procéder à l'induction et élaborer une stratégie d'alimentation postinduction efficace sont deux facteurs cruciaux qui vont dicter la productivité du système. En raison de la complexité du métabolisme des cellules de mammifères, l'optimisation ciblée des procédés de culture demeure un défi, mais ce travail peut être grandement facilite par le biais de nouvelles approches du génie métabolique. C'est le cas notamment de la technique d'analyse des flux métaboliques avec traceurs isotopiques (13C-MFA), qui a démontré qu'elle permet une caractérisation de l'état physiologique à la fois plus fine et plus robuste, mais qui a toutefois encore peu été exploitée dans le contexte de la culture de cellules animales. L'objectif principal de cette thèse était donc d'appliquer la technique d'analyse des flux métaboliques avec traceurs isotopiques afin d'effectuer une caractérisation quantitative du métabolisme primaire de cellules CHO dotées d'un système d'expression inductible, afin de permettre l'établissement systématique des principales conditions de culture et le développement rationnel d'une stratégie d'alimentation post-induction. A cette fin, des protocoles expérimentaux vii pour effectuer des expériences de marquage et des analyses par spectrométrie de masse, ainsi que les outils de calcul requis pour effectuer l'estimation des flux intracellulaires à partir de ces mesures ont du être développés ou adaptés à partir de méthodes décrites dans la littérature. En premier lieu, l'approche a été utilisée afin d'analyser le métabolisme central du carbone d'une lignée de cellules CHO en lien avec la productivité cellulaire spécifique. L'objectif était d'évaluer de façon quantitative la charge imposée par la synthèse d'une protéine recombinante sur le métabolisme primaire des cellules. Ceci a été accompli par le biais d'une analyse comparative des flux métaboliques pour des cellules induites et non-induites. Des cultures avec divers substrats marqués au C13 ont été réalisées et les distributions de masse résultantes de plusieurs métabolites extracellulaires (lactate et trois acides aminés) ont été mesurées. Ces données ont été utilisées, de concert avec des mesures de taux spécifiques de consommation et de production, pour calculer les flux métaboliques. Cette analyse a notamment révélé que l'expression d'une protéine recombinante est associée avec des différences faibles, mais néanmoins significatives pour plusieurs voies métaboliques, particulièrement celles reliées à la formation d'ATP et de NADPH, tel que le cycle de Krebs, la voie des pentose phosphate ou la voie de l'enzyme malique. Les cellules induites présentaient un métabolisme plus efficace, puisqu'une plus grande proportion du glucose, le nutriment principal, était acheminée dans le cycle TCA. A l'inverse, aucun changement majeur n'a été détecté au niveau du métabolisme des acides aminés, dont la glutamine. Comme un changement de température a été opéré au moment de l'induction pour favoriser la productivité, cette étude se voulait également la première caractérisation détaillée du métabolisme des cellules CHO sous des conditions légèrement hypothermique. Par la suite, l'impact du moment d'induction sur la productivité des cultures a été étudié, puisque ce paramètre influe à la fois sur la quantité de biomasse et sur la productivité spécifique des cellules. A cette fin, des cellules ont été prélevées à différents stades de croissance, puis ont été transférées pour être induites dans du milieu frais. Les cinétiques de croissance, de consommation et de production durant la phase de production ont été comparées pour l'ensemble des conditions d'induction. En comparaison avec les cultures induites à concentrations élevées, les cellules induites à faibles densités cellulaires ont atteint un pic de concentration plus faible, mais la longévité des cultures et la productivité spécifique des cellules étaient plus élevées, ce qui s'est traduit par une augmentation de la concentration finale en produit. Afin de mieux caractériser les effets observés sur le plan physiologique, une analyse des flux métaboliques par viii traceurs isotopiques a été réalisée pour comparer les cultures induites respectivement à faible et à haute densité cellulaire. Pour cette étude, le nombre de mesures a été étendu en considérant également les distributions de masse de deux acides organiques. En accord avec les différences observées au niveau de la croissance et de la productivité cellulaire, il a été constaté que plusieurs flux intracellulaires sont affectés par le moment d'induction. Il en a été conclu que la disponibilité des nutriments avait un impact marqué durant la phase de production après induction. Plus particulièrement, il a été révélé que le glucose est consommé plus efficacement dans le cas des cultures à haute densité, alors que la contribution des acides aminés s'en trouvait, elle, diminuée. Les résultats précédents ont été obtenus pour un changement de milieu complet au moment de l 'induction, une opération qui ne serait pas aisément transposable pour la production à grande échelle. Pour cette raison et parce que la disponibilité des nutriments semblent avoir un impact majeur sur la productivité et/ou la croissance, la possibilité d'augmenter les rendements par le biais d'une stratégie fed-batch a été explorée. Il a été constaté que des ajouts de solutions concentrées effectués post-induction augmentaient de façon substantielle la productivité des cultures par rapport au mode batch. Plus encore, il a été observé que lorsque la glutamine est alimentée en excès, les cultures atteignent des concentration cellulaires maximales plus grandes. Cependant, les cultures limitées en glutamine présentaient elles une productivité spécifique plus grande, ce qui a conduit à des rendements en produit similaires. Afin de mettre en lumière l'impact physiologique du niveau de glutamine dans l'alimentation, une étude comparative des flux métaboliques avec traceurs isotopiques a été réalisée dans des cultures en mode semicontinu. Les changements majeurs en terme de croissance et de productivité se traduisaient également par des différences observables au niveau de la distribution des flux métaboliques. Plus particulièrement, le métabolisme du lactate était grandement influencé par le niveau de glutamine alimenté aux cellules durant la phase d'induction. Globalement, l'ensemble des travaux réalisés semble suggérer une corrélation inverse entre le taux de croissance et la productivité spécifique des cellules. Les caractérisations métaboliques effectuées pourraient néanmoins procurer une bonne base pour l'identification de marqueurs physiologiques de la productivité, permettant ainsi de poursuivre le développement et l'optimisation des procédés avec induction. Ces travaux démontrent également la valeur de la technique de 13C-MFA comme outil de caractérisation du métabolisme.