Comprehensive Characterization of an Inducible Mammalian Expression System Using 13C-Metabolic Flux Analysis

La culture de cellules de mammifères constitue à ce jour la plateforme d'expression la plus utilisée dans l'industrie biopharmaceutique, en raison de la capacité inégalée de ces cellules à réaliser les modifications post-traductionnelles essentielles à la fonctionnalité des produits complexes. En raison de la forte demande pour les produits biothérapeutiques, de la volonté de diminuer les coûts associés au développement des bioprocédés et du besoin de réduire les temps de mise en marché, plusieurs progrès réalisés au cours des dernières décennies ont permis des améliorations significative en termes de rendement et de qualité du produit. Ces avancées ont été effectuées surtout grâce au développement de meilleurs vecteurs d'expression, au développement de milieux de culture plus performants et à l'application de stratégies fed-batch permettant l'atteinte de très hautes densités cellulaires. Une autre avancée récente concerne le développement de systèmes d'expression inductibles, dont l'énorme avantage est de permettre de découpler les phases de croissance et de production, conférant ainsi la possibilité d'optimiser chacune des phases indépendamment, avec des conditions opératoires spécifiques à chacune d'elles. Par ailleurs, cela permet en principe de faire croître les cellules plus rapidement avant la phase d'induction, puisque ces dernières n'ont pas à supporter la charge métabolique additionnelle qu'impose la synthèse d'une protéine recombinante. Dans de tels procédés bi-phasiques, établir le moment propice pour procéder à l'induction et élaborer une stratégie d'alimentation postinduction efficace sont deux facteurs cruciaux qui vont dicter la productivité du système. En raison de la complexité du métabolisme des cellules de mammifères, l'optimisation ciblée des procédés de culture demeure un défi, mais ce travail peut être grandement facilite par le biais de nouvelles approches du génie métabolique. C'est le cas notamment de la technique d'analyse des flux métaboliques avec traceurs isotopiques (13C-MFA), qui a démontré qu'elle permet une caractérisation de l'état physiologique à la fois plus fine et plus robuste, mais qui a toutefois encore peu été exploitée dans le contexte de la culture de cellules animales. L'objectif principal de cette thèse était donc d'appliquer la technique d'analyse des flux métaboliques avec traceurs isotopiques afin d'effectuer une caractérisation quantitative du métabolisme primaire de cellules CHO dotées d'un système d'expression inductible, afin de permettre l'établissement systématique des principales conditions de culture et le développement rationnel d'une stratégie d'alimentation post-induction. A cette fin, des protocoles expérimentaux vii pour effectuer des expériences de marquage et des analyses par spectrométrie de masse, ainsi que les outils de calcul requis pour effectuer l'estimation des flux intracellulaires à partir de ces mesures ont du être développés ou adaptés à partir de méthodes décrites dans la littérature. En premier lieu, l'approche a été utilisée afin d'analyser le métabolisme central du carbone d'une lignée de cellules CHO en lien avec la productivité cellulaire spécifique. L'objectif était d'évaluer de façon quantitative la charge imposée par la synthèse d'une protéine recombinante sur le métabolisme primaire des cellules. Ceci a été accompli par le biais d'une analyse comparative des flux métaboliques pour des cellules induites et non-induites. Des cultures avec divers substrats marqués au C13 ont été réalisées et les distributions de masse résultantes de plusieurs métabolites extracellulaires (lactate et trois acides aminés) ont été mesurées. Ces données ont été utilisées, de concert avec des mesures de taux spécifiques de consommation et de production, pour calculer les flux métaboliques. Cette analyse a notamment révélé que l'expression d'une protéine recombinante est associée avec des différences faibles, mais néanmoins significatives pour plusieurs voies métaboliques, particulièrement celles reliées à la formation d'ATP et de NADPH, tel que le cycle de Krebs, la voie des pentose phosphate ou la voie de l'enzyme malique. Les cellules induites présentaient un métabolisme plus efficace, puisqu'une plus grande proportion du glucose, le nutriment principal, était acheminée dans le cycle TCA. A l'inverse, aucun changement majeur n'a été détecté au niveau du métabolisme des acides aminés, dont la glutamine. Comme un changement de température a été opéré au moment de l'induction pour favoriser la productivité, cette étude se voulait également la première caractérisation détaillée du métabolisme des cellules CHO sous des conditions légèrement hypothermique. Par la suite, l'impact du moment d'induction sur la productivité des cultures a été étudié, puisque ce paramètre influe à la fois sur la quantité de biomasse et sur la productivité spécifique des cellules. A cette fin, des cellules ont été prélevées à différents stades de croissance, puis ont été transférées pour être induites dans du milieu frais. Les cinétiques de croissance, de consommation et de production durant la phase de production ont été comparées pour l'ensemble des conditions d'induction. En comparaison avec les cultures induites à concentrations élevées, les cellules induites à faibles densités cellulaires ont atteint un pic de concentration plus faible, mais la longévité des cultures et la productivité spécifique des cellules étaient plus élevées, ce qui s'est traduit par une augmentation de la concentration finale en produit. Afin de mieux caractériser les effets observés sur le plan physiologique, une analyse des flux métaboliques par viii traceurs isotopiques a été réalisée pour comparer les cultures induites respectivement à faible et à haute densité cellulaire. Pour cette étude, le nombre de mesures a été étendu en considérant également les distributions de masse de deux acides organiques. En accord avec les différences observées au niveau de la croissance et de la productivité cellulaire, il a été constaté que plusieurs flux intracellulaires sont affectés par le moment d'induction. Il en a été conclu que la disponibilité des nutriments avait un impact marqué durant la phase de production après induction. Plus particulièrement, il a été révélé que le glucose est consommé plus efficacement dans le cas des cultures à haute densité, alors que la contribution des acides aminés s'en trouvait, elle, diminuée. Les résultats précédents ont été obtenus pour un changement de milieu complet au moment de l 'induction, une opération qui ne serait pas aisément transposable pour la production à grande échelle. Pour cette raison et parce que la disponibilité des nutriments semblent avoir un impact majeur sur la productivité et/ou la croissance, la possibilité d'augmenter les rendements par le biais d'une stratégie fed-batch a été explorée. Il a été constaté que des ajouts de solutions concentrées effectués post-induction augmentaient de façon substantielle la productivité des cultures par rapport au mode batch. Plus encore, il a été observé que lorsque la glutamine est alimentée en excès, les cultures atteignent des concentration cellulaires maximales plus grandes. Cependant, les cultures limitées en glutamine présentaient elles une productivité spécifique plus grande, ce qui a conduit à des rendements en produit similaires. Afin de mettre en lumière l'impact physiologique du niveau de glutamine dans l'alimentation, une étude comparative des flux métaboliques avec traceurs isotopiques a été réalisée dans des cultures en mode semicontinu. Les changements majeurs en terme de croissance et de productivité se traduisaient également par des différences observables au niveau de la distribution des flux métaboliques. Plus particulièrement, le métabolisme du lactate était grandement influencé par le niveau de glutamine alimenté aux cellules durant la phase d'induction. Globalement, l'ensemble des travaux réalisés semble suggérer une corrélation inverse entre le taux de croissance et la productivité spécifique des cellules. Les caractérisations métaboliques effectuées pourraient néanmoins procurer une bonne base pour l'identification de marqueurs physiologiques de la productivité, permettant ainsi de poursuivre le développement et l'optimisation des procédés avec induction. Ces travaux démontrent également la valeur de la technique de 13C-MFA comme outil de caractérisation du métabolisme.

Abstract

Mammalian cell cultures have become the predominant production platform in today's multibillion dollar biopharmaceutical industry. Mammalian cells have the unique capacity to synthesize recombinant proteins with proper folding and post-translational modifications. Due to the increasing demand for biotherapeutics, the pressure to reduce the costs associated with process development and the need to shorten the time to market, continuous efforts have been made in mammalian cell technologies to maximize both the product yields and quality. This has been mostly achieved through the design of enhanced expression vectors, improved medium formulations and the application of fed-batch strategies supporting high cell densities. In recent years, there has been also a growing interest in the development of inducible mammalian expression systems, which allow decoupling of the growth and production phases and open up the possibility to define specific operating conditions that are favorable for each phase. Moreover, cells can presumably be grown more rapidly before induction, as they do not have the extra metabolic burden associated with recombinant protein expression. In such biphasic systems, a suitable timing for induction and an efficient feeding protocol pre/post-induction are among the most crucial factors to ensure a high volumetric productivity. Due to the complex metabolism of mammalian cells, the targeted optimization of cell culture processes remains challenging, but can be greatly facilitated with the aid of new metabolic engineering approaches. In particular, the use of isotopic tracers and 13C-metabolic flux analysis (13C-MFA) was shown to provide a more detailed and accurate description of cellular physiology than the classical metabolite balancing technique, although its application to mammalian cells is still in its infancy. The main objective of this work was thus to apply 13C-metabolic flux analysis to quantitatively characterize the primary metabolism of recombinant CHO cells harboring an efficient inducible expression system, as a systematic approach to guide the determination of key process conditions and allow the rational development of a feeding protocol to increase culture productivity. To this end, analytical methods for conducting informative labeling experiments and mass spectrometry measurements, as well as computational tools allowing reliable metabolic flux quantification had to be developed or adapted from the literature. First, this method was used to analyze the central carbon metabolism of a recombinant CHO cell line in relation with cellular productivity. The goal was to quantitatively evaluate the burden x imposed by recombinant protein expression on the primary metabolism of cells in culture. This was achieved by conducting a comparative study of the intracellular flux map distribution with and without the induction of recombinant protein expression. We performed cultures with multiple 13C-labeled substrates and measured the resulting mass distribution of extracellular metabolites (lactate and three amino acids) by mass spectrometry. This additional data was used in conjunction with extracellular rate measurements to obtain reliable metabolic flux estimates. Through this analysis, we have notably demonstrated that heterologous protein expression is correlated with small, but significant differences in a number of important intracellular pathways, most of them related to ATP and NADPH formation, including the pentose phosphate pathway, the malic enzyme reaction and the TCA cycle. Induced cells were found to exhibit an increased flux of pyruvate into the TCA cycle, indicative of a more efficient glucose utilization. However, no significant difference could be inferred with respect to amino acid metabolism, including glutamine. Since a temperature shift was performed at the time of induction, this study was also the first comprehensive characterization of CHO cell metabolism under mild-hypothermia conditions. We have then investigated the impact of the timing of induction on culture productivity, since this parameter can affect both the cumulative biomass concentration and the cell specific productivity. Cells taken at different stages of growth were transferred and induced in fresh medium and the kinetics of growth, nutrient consumption and product formation were compared during the production phase. Compared to cultures induced at a high cell concentration, low cell density inductions achieved lower maximum cell concentrations, but exhibited higher cell specific productivity and greater culture longevity, which gave a greater final product titers. To gain more physiological insights into the observed differences, 13C-metabolic flux analysis was performed to characterize and compare the metabolism of cells induced at respectively low and high cell densities. The range of measurements was extended by including the mass distributions of two organic acids. In line with differences observed in terms of growth and productivity, several calculated intracellular fluxes were found to be affected by the timing of induction. It was inferred that the corresponding availability of nutrients had a determinant impact on the induction phase. Most notably, glucose utilization efficiency was increased in high cell density induction, whereas the contribution of amino acids became marginal. xi The previous results were however obtained by doing a complete medium exchange at the time of induction, an operation which cannot be easily implemented at large-scale. For this reason and since the results implied a strong correlation between nutrient availability and cellular growth/productivity, we then explored the possibility to increase the product yield by using a fedbatch process. We found that performing concentrated feed additions post-induction greatly increase the productivity of cultures compared to induction in batch mode. More interestingly, we observed that when glutamine was fed in excess to the cells, the cultures reached greater maximum cell concentrations. While cell growth was comparatively lower in glutamine-limited fed-batch, the final product titers were found to be similar, indicative of an increased cell specific productivity. To further assess the physiological impact of glutamine levels on the cells, a comparative 13C-metabolic flux analysis was conducted in semi-continuous cultures to analyze both culture regimes. The marked changes in cellular growth and productivity were clearly reflected in the metabolism of the cells. In particular, lactate metabolism was found to be greatly influenced by the amount of glutamine present in the feed during the production phase. Overall, the results from all our studies tend to suggest that there may be some negative correlation between cell growth and cellular productivity. Nonetheless, the metabolic characterizations performed in this work may provide useful clues for the identification of physiological markers of cell growth and/or productivity that could further guide the optimization of inducible expression systems. Our work also demonstrates that 13C-metabolic flux analysis is a valuable tool for characterizing cell metabolism and supporting cell culture process optimization.