Détermination de l'impact du pentachlorophénol sur la diversité bactérienne dans les sols à partir de la technique de l'électrophorèse sur gel en gradient dénaturant

Les communautés microbiennes dans les sols sont parmi les plus diversifiées sur Terre. Ce faisant, les microorganismes du sol assurent en majeure partie plusieurs fonctions des sols tels que le cycle des nutriments et la détoxification des écosystèmes terrestres. En affectant cette diversité, la contamination des milieux naturels constitue un risque important pouvant réduire la capacité des écosystèmes à résister et récupérer aux différentes perturbations qu'ils doivent subir. La diversité des écosystèmes naturels est donc une richesse à préserver. Effectivement, il a été montré que les écosystèmes plus diversifiés étaient plus résistants et résilients aux perturbations naturelles et anthropiques. Depuis le début de l'ère industrielle, la diversité des écosystèmes naturels est en constant déclin à cause, notamment, de la contamination des sols, de l'air et des cours d'eau. Afin de prédire l'effet d'une substance sur une communauté biologique et ainsi contrôler ou limiter son utilisation, il est nécessaire de produire de l'information toxicologique sur une large gamme d'organismes. Les données écotoxiques représentatives des différentes espèces testées seront colligées et utilisées afin d'estimer l'effet d'un contaminant sur toute une communauté. Lorsque le centre d'intérêt est une communauté biologique évoluant en milieu terrestre, force est de constater que la disponibilité de ces indicateurs est très problématique. Les communautés microbiennes des sols sont nécessaires au bon fonctionnement, à long terme, des écosystèmes terrestres. Or, ces dernières sont virtuellement absentes des bases de données écotoxiques. L'absence de données pour ce groupe très important n'est pas étrangère au fait que l'étude d'organismes aussi petits pose des difficultés techniques particulières. Ainsi, la majorité des publications s'étant intéressées à l'effet des contaminants sur les microorganismes du sol ont utilisé des indicateurs fonctionnels liés directement ou indirectement à ces organismes. Les indicateurs les plus utilisés sont les mesures de biomasse microbienne, d'activité microbienne et d'activité enzymatique. Bien que très utiles afin de déterminer l'état de santé d'un sol, ces indicateurs ont montré certaines limites importantes. Puisque les mesures fonctionnelles sont très intégratrices (toutes les espèces y participent), plusieurs auteurs ont noté que certains de ces indicateurs avaient le potentiel d'augmenter suite à une contamination. En fractionnant les communautés microbiennes en plusieurs sous-parties (les espèces), les indices de diversité, qui considèrent à la fois le nombre d'espèces présentes et l'abondance relative de chaque espèce, pourraient être beaucoup plus sensibles à une contamination que les indicateurs fonctionnels. Par contre, il est techniquement difficile d'estimer précisément la diversité des communautés microbiennes des sols. D'abord, les méthodes moléculaires utilisées afin d'étudier la diversité microbienne des sols ne permet pas de cibler simultanément tous les microorganismes du sol. Des trois sous-groupes composant les communautés microbiennes des sols (bactéries, archées et champignons), les bactéries sont les plus diversifiées et sont le plus souvent ciblées. Ensuite, il a été montré que les populaires techniques de profilage, qui ne donnent de l'information que sur les espèces les plus abondantes, sont incapables de produire des estimés de diversité corrélés à la diversité bactérienne réelle des sols. Les nouvelles technologies de séquençage d'ADN récemment arrivées sur le marché ont le potentiel de permettre l'étude quantitative de la diversité bactérienne des sols. Par contre, plusieurs auteurs ont montré que certaines difficultés techniques pourraient générer des distorsions dans les estimés de diversité produits par ces plateformes, bien que l'importance quantitative de ces distorsions n'ait jamais été clairement établie. Aussi, la disponibilité de ces appareils peut être problématique pour plusieurs chercheurs. Plusieurs limitations ont été identifiées afin d'estimer l'effet des contaminants dans les écosystèmes terrestres. L'information toxicologique pour les espèces terrestres est très limitée et ne concerne souvent que quelques espèces. Considérant qu'ils sont virtuellement absents des bases de données écotoxiques, la génération de données de toxicité spécifiques aux bactéries du sol constitue un moyen permettant de s'attaquer à cette problématique. Vu l'importance de ces communautés dans les écosystèmes, tant du point de vue de leur diversité que de celui de leur importance fonctionnelle, ces données constitueraient de l'information hautement pertinente afin de mieux comprendre l'effet des contaminants en milieux terrestres. Pour ce faire, une mesure de toxicité basée sur la diversité génétique des communautés bactériennes dans les sols présente plusieurs avantages par rapport aux indicateurs fonctionnels souvent utilisés par le passé. Par contre, l'utilisation de la diversité microbienne en tant qu'indicateur de toxicité présente également des difficultés, la plus importante étant la capacité des techniques actuelles à produire des estimés quantitatifs de diversité. Il a été évoqué qu'une technique de profilage très répandue, l'électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE), pourrait posséder cette capacité. Donnant généralement de l'information uniquement sur les espèces les plus abondantes des communautés étudiées, il a été montré que cette technique pourrait également contenir de l'information sur leur richesse. Par contre, aucune approche n'a pour le moment été développée afin d'utiliser cette information. De plus, l'analyse des profils DGGE présente des difficultés particulières lorsque des communautés très diversifiées sont étudiées. Dès lors, il est difficile d'affirmer que l'information produite sur les espèces les plus abondantes des communautés est quantitativement représentative. Afin de développer une approche permettant d'utiliser toute l'information extraite des profils DGGE, le pentachlorophénol semble être une substance idéale. En effet, ce contaminant se retrouve fréquemment dans les écosystèmes naturels canadiens, possède des propriétés physico-chimiques susceptibles de faire varier sa toxicité en fonction de la composition du sol utilisé et a été testé sur plusieurs espèces terrestres différentes. De plus, son effet sur les microorganismes du sol a fait l'objet de quelques publications. Il sera intéressant de comparer la réponse et la sensibilité d'un indicateur basé sur la diversité bactérienne des sols à des mesures biochimiques. À cette fin, la mesure du potentiel d'activité hydrolytique de la fluorescéine diacétate, un essai simple produisant des résultats corrélés aux mesures de biomasse microbienne, semble être idéale. Effectivement, la biomasse microbienne s'est avérée être un indicateur sensible au pentachlorophénol dans quelques études différentes. Sur la base des limitations identifiées, les objectifs principaux de ce projet sont les suivants : 1. Proposer une approche analytique permettant d'extraire des profils DGGE de l'information quantitative sur la dominance et la richesse des communautés étudiées; 2. Développer, à partir de profils DGGE in silico, un modèle empirique permettant de produire des estimés de diversité corrélés à la diversité des communautés étudiées à partir de l'information extraite des profils DGGE; 3. Valider ce modèle sur des échantillons réels en comparant la diversité estimée à partir du DGGE à celle produite par une nouvelle technologie de séquençage d'ADN; 4. Quantifier l'effet du pentachlorophénol sur la diversité bactérienne des sols et comparer cette réponse à celle basée sur la mesure du potentiel d'activité hydrolytique de la fluorescéine diacétate des sols. Sur la base de ces objectifs, une approche analytique a été développée à partir de profils DGGE in silico à l'aide du logiciel Matlab. Contrairement aux logiciels d'analyse de gels commerciaux, qui soustraient le bruit de fond à l'aide d'une bille virtuelle roulant sous les profils DGGE, cette approche utilise un profil de bruit de fond défini manuellement par l'utilisateur. Le bruit de fond ainsi soustrait est utilisé afin de définir un nouveau paramètre, le ratio pic-sur-signal, qui contient l'information sur la richesse des communautés étudiées. Une fois le bruit de fond soustrait, l'information sur les espèces les plus abondantes de la communauté est générée à l'aide d'un algorithme d'optimisation facilitant l'analyse de profils complexes. À partir des informations extraites des gels DGGE (abondance relative des espèces les plus abondantes et richesse des communautés), un modèle empirique a été développé afin de produire des estimés de diversité quantitatifs à partir du DGGE. La distribution rang-abondance produite par l'analyse des bandes DGGE est premièrement multipliée par le ratio pic-sur signal extrait du profil. Par la suite, en utilisant un modèle d'abondance empirique, la distribution loi de puissance, un modèle d'élongation des distributions rang-abondance DGGE a été développé. Ce modèle a été paramétré en observant les distributions rang-abondance des communautés bactériennes in silico utilisées afin de construire les profils analysés. Puisque le paramétrage du modèle dépend du ratio pic-sur-signal de l'échantillon analysé, le processus d'élongation est propre à chaque échantillon. Afin de valider ce modèle d'élongation, les communautés bactériennes des mêmes échantillons de sol ont été étudiées à partir du DGGE et de l'Ion Torrent, une nouvelle technologie de séquençage. Deux sols de texture différente ont été utilisés afin de valider ce modèle. Chaque sol a été contaminé avec du pentachlorophénol, à trois concentrations différentes (en plus de l'échantillon non contaminé). Afin d'étudier l'effet écotoxique du pentachlorophénol sur la diversité bactérienne des sols, les deux sols mentionnés ci-haut ont été contaminés cette fois à sept concentrations différentes, en triplicata. En parallèle, l'activité hydrolytique de la fluorescéine diacétate a été mesurée dans tous les échantillons de sol. La diversité et l'activité hydrolytique de tous les échantillons ont été utilisées afin de produire des courbes concentration-réponse représentatives de l'effet du PCP sur les communautés bactériennes (diversité) ou, plus généralement, microbienne (activité de la fluorescéine diacétate). Aussi, en utilisant les données écotoxiques terrestres disponibles dans les bases de données pour le pentachlorophénol, une courbe de sensibilité des espèces a été tracée pour ce contaminant. Les indicateurs écotoxiques extraits des courbes concentration-réponse et de la courbe de sensibilité des espèces ont été comparés. En travaillant sur des profils DGGE in silico, il a été montré que la représentativité des résultats générés par les approches analytiques généralement employées pour analyser les gels DGGE et implémentées dans trois logiciels commerciaux variait d'un échantillon à l'autre. Au contraire, l'approche analytique développée dans le cadre de ce projet a permis d'extraire des profils DGGE des ratios pics-sur signal précis et de produire des patrons de dominance représentatifs des communautés étudiées. Il a été montré que ces patrons de dominance étaient très semblables à ceux générés par le groupement des séquences utilisées pour construire les profils DGGE si un pourcentage de similitude de 98% était utilisé. Le modèle d'élongation calibré à partir des distributions rang-abondance produites en groupant les séquences d'ADN avec un pourcentage de similitude de 98% a montré un très fort potentiel afin de permettre l'estimation de la diversité bactérienne à partir du DGGE. Ainsi, il a été possible d'estimer la diversité réelle des communautés étudiées avec une précision généralement supérieure à ± 5%. Une corrélation très significative existait entre les indices de diversité réels et ceux estimés à partir du DGGE (R2 > 0,99). En utilisant deux approches différentes afin d'étudier les mêmes communautés bactériennes, il a été possible d'identifier des distorsions dans les résultats de chacune des approches. Ainsi, il a été montré que le fait d'injecter une grande quantité d'ADN (~ 400 ng) dans les puits DGGE risquait de causer une saturation locale du gel. Cette saturation, qui survient dans les régions du gel où une grande quantité d'ADN migre, peut empêcher les bandes DGGE les plus brillantes d'atteindre leurs intensités maximales. Injecter moins d'ADN (~ 200 ng) a permis de régler les problèmes liés à la saturation des gels. La situation s'est avérée être plus complexe pour les résultats générés par l'Ion Torrent. Utilisée à la limite de ses capacités, la qualité des résultats de séquençage produits par cette plateforme fut problématique. Ainsi, des distorsions liées à la faible profondeur de séquençage atteinte et aux erreurs de séquençage furent identifiés. De plus, il a été qualitativement montré que le pourcentage GC des séquences risquait de causer des distorsions intra-échantillons dans l'abondance relative des espèces. Le fait de réduire l'influence de ces distorsions sur les estimés de diversité produits par chaque approche a permis l'obtention de corrélations significatives (R2 > 0,81) entre les deux séries de données. Lorsqu'utilisées à des fins comparatives, ces deux technologies peuvent donc mener à des résultats quantitativement similaires. Lors de la construction des courbes concentration-réponse à partir des indices de diversité mesurés pour les différents échantillons de sol, il a été possible de remarquer que les échantillons de sol les plus contaminés n'étaient pas les moins diversifiés. Cette observation peut s'expliquer de deux façons différentes. Le pentachlorophénol a pu avoir un effet toxique sur toutes les espèces bactériennes, empêchant ainsi l'apparition de bandes DGGE brillantes sur les profils et permettant par le fait même à certaines espèces d'être suffisamment abondante (proportionnellement) afin de produire une bande visible sur le gel. Alternativement, ou parallèlement, il est possible que le temps d'incubation de 28 jours n'ait pas permis la dégradation de l'ADN des bactéries tuées par l'ajout de pentachlorophénol. Malgré ces observations, les indices de diversité se sont avérés être beaucoup plus sensibles (plus de 25 fois) au pentachlorophénol que les mesures d'activité hydrolytique de la fluorescéine diacétate. De plus, les courbes concentration-réponse tracées à l'aide des mesures de diversité se sont avérées très similaires à la courbe de sensibilité des espèces représentative du pentachlorophénol. Ainsi, cette thèse a permis le développement d'une méthodologie permettant de comparer la diversité de communautés bactériennes de différents sols à l'aide du DGGE, une approche très répandue qui n'avait préalablement pas cette capacité. De plus, il a été possible de montrer que les indices de diversité sont plus sensibles au pentachlorophénol que certains indicateurs fonctionnels, et que la réponse des communautés bactériennes face à une exposition au pentachlorophénol était très similaire à la réponse des communautés macroscopiques terrestres exposées à la même substance. Si ces observations peuvent être généralisées sur plus de contaminants, l'approche proposée dans cette thèse constituera un outil excessivement puissant afin de mieux comprendre l'effet des contaminants ou des mélanges complexes sur les communautés biotiques terrestres. Et si cette similitude est tout simplement fortuite, le cadre de travail présenté dans cette thèse sera tout de même en mesure de produire de l'information écotoxicologique sur les communautés bactériennes, archéennes et fongiques des sols, trois groupes absents des bases de données écotoxicologiques.