Détermination de l'impact du pentachlorophénol sur la diversité bactérienne dans les sols à partir de la technique de l'électrophorèse sur gel en gradient dénaturant

Les communautés microbiennes dans les sols sont parmi les plus diversifiées sur Terre. Ce faisant, les microorganismes du sol assurent en majeure partie plusieurs fonctions des sols tels que le cycle des nutriments et la détoxification des écosystèmes terrestres. En affectant cette diversité, la contamination des milieux naturels constitue un risque important pouvant réduire la capacité des écosystèmes à résister et récupérer aux différentes perturbations qu'ils doivent subir. La diversité des écosystèmes naturels est donc une richesse à préserver. Effectivement, il a été montré que les écosystèmes plus diversifiés étaient plus résistants et résilients aux perturbations naturelles et anthropiques. Depuis le début de l'ère industrielle, la diversité des écosystèmes naturels est en constant déclin à cause, notamment, de la contamination des sols, de l'air et des cours d'eau. Afin de prédire l'effet d'une substance sur une communauté biologique et ainsi contrôler ou limiter son utilisation, il est nécessaire de produire de l'information toxicologique sur une large gamme d'organismes. Les données écotoxiques représentatives des différentes espèces testées seront colligées et utilisées afin d'estimer l'effet d'un contaminant sur toute une communauté. Lorsque le centre d'intérêt est une communauté biologique évoluant en milieu terrestre, force est de constater que la disponibilité de ces indicateurs est très problématique. Les communautés microbiennes des sols sont nécessaires au bon fonctionnement, à long terme, des écosystèmes terrestres. Or, ces dernières sont virtuellement absentes des bases de données écotoxiques. L'absence de données pour ce groupe très important n'est pas étrangère au fait que l'étude d'organismes aussi petits pose des difficultés techniques particulières. Ainsi, la majorité des publications s'étant intéressées à l'effet des contaminants sur les microorganismes du sol ont utilisé des indicateurs fonctionnels liés directement ou indirectement à ces organismes. Les indicateurs les plus utilisés sont les mesures de biomasse microbienne, d'activité microbienne et d'activité enzymatique. Bien que très utiles afin de déterminer l'état de santé d'un sol, ces indicateurs ont montré certaines limites importantes. Puisque les mesures fonctionnelles sont très intégratrices (toutes les espèces y participent), plusieurs auteurs ont noté que certains de ces indicateurs avaient le potentiel d'augmenter suite à une contamination. En fractionnant les communautés microbiennes en plusieurs sous-parties (les espèces), les indices de diversité, qui considèrent à la fois le nombre d'espèces présentes et l'abondance relative de chaque espèce, pourraient être beaucoup plus sensibles à une contamination que les indicateurs fonctionnels. Par contre, il est techniquement difficile d'estimer précisément la diversité des communautés microbiennes des sols. D'abord, les méthodes moléculaires utilisées afin d'étudier la diversité microbienne des sols ne permet pas de cibler simultanément tous les microorganismes du sol. Des trois sous-groupes composant les communautés microbiennes des sols (bactéries, archées et champignons), les bactéries sont les plus diversifiées et sont le plus souvent ciblées. Ensuite, il a été montré que les populaires techniques de profilage, qui ne donnent de l'information que sur les espèces les plus abondantes, sont incapables de produire des estimés de diversité corrélés à la diversité bactérienne réelle des sols. Les nouvelles technologies de séquençage d'ADN récemment arrivées sur le marché ont le potentiel de permettre l'étude quantitative de la diversité bactérienne des sols. Par contre, plusieurs auteurs ont montré que certaines difficultés techniques pourraient générer des distorsions dans les estimés de diversité produits par ces plateformes, bien que l'importance quantitative de ces distorsions n'ait jamais été clairement établie. Aussi, la disponibilité de ces appareils peut être problématique pour plusieurs chercheurs. Plusieurs limitations ont été identifiées afin d'estimer l'effet des contaminants dans les écosystèmes terrestres. L'information toxicologique pour les espèces terrestres est très limitée et ne concerne souvent que quelques espèces. Considérant qu'ils sont virtuellement absents des bases de données écotoxiques, la génération de données de toxicité spécifiques aux bactéries du sol constitue un moyen permettant de s'attaquer à cette problématique. Vu l'importance de ces communautés dans les écosystèmes, tant du point de vue de leur diversité que de celui de leur importance fonctionnelle, ces données constitueraient de l'information hautement pertinente afin de mieux comprendre l'effet des contaminants en milieux terrestres. Pour ce faire, une mesure de toxicité basée sur la diversité génétique des communautés bactériennes dans les sols présente plusieurs avantages par rapport aux indicateurs fonctionnels souvent utilisés par le passé. Par contre, l'utilisation de la diversité microbienne en tant qu'indicateur de toxicité présente également des difficultés, la plus importante étant la capacité des techniques actuelles à produire des estimés quantitatifs de diversité. Il a été évoqué qu'une technique de profilage très répandue, l'électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE), pourrait posséder cette capacité. Donnant généralement de l'information uniquement sur les espèces les plus abondantes des communautés étudiées, il a été montré que cette technique pourrait également contenir de l'information sur leur richesse. Par contre, aucune approche n'a pour le moment été développée afin d'utiliser cette information. De plus, l'analyse des profils DGGE présente des difficultés particulières lorsque des communautés très diversifiées sont étudiées. Dès lors, il est difficile d'affirmer que l'information produite sur les espèces les plus abondantes des communautés est quantitativement représentative. Afin de développer une approche permettant d'utiliser toute l'information extraite des profils DGGE, le pentachlorophénol semble être une substance idéale. En effet, ce contaminant se retrouve fréquemment dans les écosystèmes naturels canadiens, possède des propriétés physico-chimiques susceptibles de faire varier sa toxicité en fonction de la composition du sol utilisé et a été testé sur plusieurs espèces terrestres différentes. De plus, son effet sur les microorganismes du sol a fait l'objet de quelques publications. Il sera intéressant de comparer la réponse et la sensibilité d'un indicateur basé sur la diversité bactérienne des sols à des mesures biochimiques. À cette fin, la mesure du potentiel d'activité hydrolytique de la fluorescéine diacétate, un essai simple produisant des résultats corrélés aux mesures de biomasse microbienne, semble être idéale. Effectivement, la biomasse microbienne s'est avérée être un indicateur sensible au pentachlorophénol dans quelques études différentes. Sur la base des limitations identifiées, les objectifs principaux de ce projet sont les suivants : 1. Proposer une approche analytique permettant d'extraire des profils DGGE de l'information quantitative sur la dominance et la richesse des communautés étudiées; 2. Développer, à partir de profils DGGE in silico, un modèle empirique permettant de produire des estimés de diversité corrélés à la diversité des communautés étudiées à partir de l'information extraite des profils DGGE; 3. Valider ce modèle sur des échantillons réels en comparant la diversité estimée à partir du DGGE à celle produite par une nouvelle technologie de séquençage d'ADN; 4. Quantifier l'effet du pentachlorophénol sur la diversité bactérienne des sols et comparer cette réponse à celle basée sur la mesure du potentiel d'activité hydrolytique de la fluorescéine diacétate des sols. Sur la base de ces objectifs, une approche analytique a été développée à partir de profils DGGE in silico à l'aide du logiciel Matlab. Contrairement aux logiciels d'analyse de gels commerciaux, qui soustraient le bruit de fond à l'aide d'une bille virtuelle roulant sous les profils DGGE, cette approche utilise un profil de bruit de fond défini manuellement par l'utilisateur. Le bruit de fond ainsi soustrait est utilisé afin de définir un nouveau paramètre, le ratio pic-sur-signal, qui contient l'information sur la richesse des communautés étudiées. Une fois le bruit de fond soustrait, l'information sur les espèces les plus abondantes de la communauté est générée à l'aide d'un algorithme d'optimisation facilitant l'analyse de profils complexes. À partir des informations extraites des gels DGGE (abondance relative des espèces les plus abondantes et richesse des communautés), un modèle empirique a été développé afin de produire des estimés de diversité quantitatifs à partir du DGGE. La distribution rang-abondance produite par l'analyse des bandes DGGE est premièrement multipliée par le ratio pic-sur signal extrait du profil. Par la suite, en utilisant un modèle d'abondance empirique, la distribution loi de puissance, un modèle d'élongation des distributions rang-abondance DGGE a été développé. Ce modèle a été paramétré en observant les distributions rang-abondance des communautés bactériennes in silico utilisées afin de construire les profils analysés. Puisque le paramétrage du modèle dépend du ratio pic-sur-signal de l'échantillon analysé, le processus d'élongation est propre à chaque échantillon. Afin de valider ce modèle d'élongation, les communautés bactériennes des mêmes échantillons de sol ont été étudiées à partir du DGGE et de l'Ion Torrent, une nouvelle technologie de séquençage. Deux sols de texture différente ont été utilisés afin de valider ce modèle. Chaque sol a été contaminé avec du pentachlorophénol, à trois concentrations différentes (en plus de l'échantillon non contaminé). Afin d'étudier l'effet écotoxique du pentachlorophénol sur la diversité bactérienne des sols, les deux sols mentionnés ci-haut ont été contaminés cette fois à sept concentrations différentes, en triplicata. En parallèle, l'activité hydrolytique de la fluorescéine diacétate a été mesurée dans tous les échantillons de sol. La diversité et l'activité hydrolytique de tous les échantillons ont été utilisées afin de produire des courbes concentration-réponse représentatives de l'effet du PCP sur les communautés bactériennes (diversité) ou, plus généralement, microbienne (activité de la fluorescéine diacétate). Aussi, en utilisant les données écotoxiques terrestres disponibles dans les bases de données pour le pentachlorophénol, une courbe de sensibilité des espèces a été tracée pour ce contaminant. Les indicateurs écotoxiques extraits des courbes concentration-réponse et de la courbe de sensibilité des espèces ont été comparés. En travaillant sur des profils DGGE in silico, il a été montré que la représentativité des résultats générés par les approches analytiques généralement employées pour analyser les gels DGGE et implémentées dans trois logiciels commerciaux variait d'un échantillon à l'autre. Au contraire, l'approche analytique développée dans le cadre de ce projet a permis d'extraire des profils DGGE des ratios pics-sur signal précis et de produire des patrons de dominance représentatifs des communautés étudiées. Il a été montré que ces patrons de dominance étaient très semblables à ceux générés par le groupement des séquences utilisées pour construire les profils DGGE si un pourcentage de similitude de 98% était utilisé. Le modèle d'élongation calibré à partir des distributions rang-abondance produites en groupant les séquences d'ADN avec un pourcentage de similitude de 98% a montré un très fort potentiel afin de permettre l'estimation de la diversité bactérienne à partir du DGGE. Ainsi, il a été possible d'estimer la diversité réelle des communautés étudiées avec une précision généralement supérieure à ± 5%. Une corrélation très significative existait entre les indices de diversité réels et ceux estimés à partir du DGGE (R2 > 0,99). En utilisant deux approches différentes afin d'étudier les mêmes communautés bactériennes, il a été possible d'identifier des distorsions dans les résultats de chacune des approches. Ainsi, il a été montré que le fait d'injecter une grande quantité d'ADN (~ 400 ng) dans les puits DGGE risquait de causer une saturation locale du gel. Cette saturation, qui survient dans les régions du gel où une grande quantité d'ADN migre, peut empêcher les bandes DGGE les plus brillantes d'atteindre leurs intensités maximales. Injecter moins d'ADN (~ 200 ng) a permis de régler les problèmes liés à la saturation des gels. La situation s'est avérée être plus complexe pour les résultats générés par l'Ion Torrent. Utilisée à la limite de ses capacités, la qualité des résultats de séquençage produits par cette plateforme fut problématique. Ainsi, des distorsions liées à la faible profondeur de séquençage atteinte et aux erreurs de séquençage furent identifiés. De plus, il a été qualitativement montré que le pourcentage GC des séquences risquait de causer des distorsions intra-échantillons dans l'abondance relative des espèces. Le fait de réduire l'influence de ces distorsions sur les estimés de diversité produits par chaque approche a permis l'obtention de corrélations significatives (R2 > 0,81) entre les deux séries de données. Lorsqu'utilisées à des fins comparatives, ces deux technologies peuvent donc mener à des résultats quantitativement similaires. Lors de la construction des courbes concentration-réponse à partir des indices de diversité mesurés pour les différents échantillons de sol, il a été possible de remarquer que les échantillons de sol les plus contaminés n'étaient pas les moins diversifiés. Cette observation peut s'expliquer de deux façons différentes. Le pentachlorophénol a pu avoir un effet toxique sur toutes les espèces bactériennes, empêchant ainsi l'apparition de bandes DGGE brillantes sur les profils et permettant par le fait même à certaines espèces d'être suffisamment abondante (proportionnellement) afin de produire une bande visible sur le gel. Alternativement, ou parallèlement, il est possible que le temps d'incubation de 28 jours n'ait pas permis la dégradation de l'ADN des bactéries tuées par l'ajout de pentachlorophénol. Malgré ces observations, les indices de diversité se sont avérés être beaucoup plus sensibles (plus de 25 fois) au pentachlorophénol que les mesures d'activité hydrolytique de la fluorescéine diacétate. De plus, les courbes concentration-réponse tracées à l'aide des mesures de diversité se sont avérées très similaires à la courbe de sensibilité des espèces représentative du pentachlorophénol. Ainsi, cette thèse a permis le développement d'une méthodologie permettant de comparer la diversité de communautés bactériennes de différents sols à l'aide du DGGE, une approche très répandue qui n'avait préalablement pas cette capacité. De plus, il a été possible de montrer que les indices de diversité sont plus sensibles au pentachlorophénol que certains indicateurs fonctionnels, et que la réponse des communautés bactériennes face à une exposition au pentachlorophénol était très similaire à la réponse des communautés macroscopiques terrestres exposées à la même substance. Si ces observations peuvent être généralisées sur plus de contaminants, l'approche proposée dans cette thèse constituera un outil excessivement puissant afin de mieux comprendre l'effet des contaminants ou des mélanges complexes sur les communautés biotiques terrestres. Et si cette similitude est tout simplement fortuite, le cadre de travail présenté dans cette thèse sera tout de même en mesure de produire de l'information écotoxicologique sur les communautés bactériennes, archéennes et fongiques des sols, trois groupes absents des bases de données écotoxicologiques.

Abstract

Soil microbial communities are among the most diversified on Earth and play key roles in many soil-mediated functions such as biogeochemical cycles and xenobiotics degradation. Affecting this diversity, soil contamination constitutes an important risk having the potential to reduce the capacity of terrestrial ecosystems to resist and recover from the many natural and anthropogenic perturbations that they must undergo. As many authors have shown, diversified ecosystems are more resistant and resilient to perturbations and diversity is an asset that must be preserved. However, since the beginning of the industrial era, soil, air and water contamination leads to a constant decrease in natural ecosystems' diversity. In order to protect ecosystems from diversity losses caused by xenobiotics, ecotoxicological information about many different species is required. This information on single species will be compiled and used to draw a species sensitivity distribution that allows estimating the effect of a contaminant on a whole ecosystem. For terrestrial ecosystems, data scarcity is a major limitation to the application of this framework. Although necessary to the long term functioning of terrestrial ecosystems, soil microbial communities are virtually absent from terrestrial ecotoxicological databases. A major reason for that is linked with the technical difficulties in studying such small organisms. Most of the publications that focused on the effect of xenobiotics to microbial communities measured functional parameters directly or indirectly linked to soil microorganisms, such as microbial biomass or activity and enzymes activity. Although highly informative of soil health, these indicators showed important limitations when used as toxicity indicators. Being very integrative, those measures often showed increases after soil contamination, especially if the tested contaminant is biodegradable. Fractionating microbial communities into smaller distinct parts – the species – ecological diversity indices that consider simultaneously the richness of the community (number of species) and the relative abundance of the different species could be more sensitive to xenobiotics than functional parameters. However, it is still technically difficult to accurately estimate the diversity of soil microbial communities. First of all, the molecular approaches used to study microbial diversity are not able to consider at once all the microorganisms (bacteria, archaea and fungi) composing these communities. As a consequence, bacterial communities – the most diversified of these subgroups – are selected by most of the authors. Then, it was shown that the widespread profiling methods – only able to yield quantitative information about the relative abundance of the most abundant species – are unable to produce diversity estimates correlated to the actual diversity of soil bacterial communities. The newer next-generation DNA sequencing technologies theoretically allow studying the diversity of bacterial communities with an unprecedented depth. However, many authors showed that diversity estimates produced from sequencing results may be biased to an unknown extent. Furthermore, sequencer availability may still be problematic for many researchers. Many limitations hampering the estimation of the effect of xenobiotics in terrestrial ecosystems have been identified. Terrestrial ecotoxicological data are scarce and do not concern enough different species. Being almost absent in the ecotoxicological databases, generating data about soil bacterial communities allows us to tackle this problem. Furthermore, considering their importance in terrestrial ecosystems, generating information about the effect of xenobiotics to these communities would be of high environmental relevance. To do so, ecological diversity indices present many advantages compared with functional indicators, but also many difficulties. Being able to accurately estimate the diversity of these very complex communities is, without a doubt, the major one. In one publication, it was shown that denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) – a widespread profiling method – is theoretically able to yield quantitative information on the relative abundance of the dominant species, but also on the richness of the studied communities. However, no framework has been developed in order to use this information. Furthermore, the analysis of complex DGGE migration profiles of soil bacterial communities presents many difficulties. It is therefore hard to say that the information extracted from the DGGE migration profiles can be used to quantitatively study bacterial community diversity. In order to develop a framework allowing quantifying the effect of xenobiotics on the diversity of soil bacterial communities, pentachlorophenol seems to be an ideal case study. This contaminant is ubiquitous in Canadian terrestrial ecosystems, possesses interesting physico-chemical properties potentially allowing this substance to exhibit different toxicities in different soil types and, most of all, was tested on many different terrestrial species. Furthermore, its effect on soil microorganisms was already studied by some authors. It will be interesting to compare the sensitivity of ecological diversity indices and functional measures to detect pentachlorophenol. To do so, the assay of fluorescein diacetate hydrolytic activity seems to be perfectly suited; it is a simple assay producing results well correlated with microbial biomass measures that were shown by some authors to be sensitive to pentachlorophenol contamination. On the basis of the above-mentioned limitations, the projects' main objectives are the following: 1. Develop an analytical approach allowing the extraction from DGGE migration profiles information on the relative abundance of the dominant species and on the richness of the studied communities; 2. Using in silico DGGE migration profiles, develop an empirical framework allowing the accurate estimation of the diversity of soil bacterial communities using the information extracted from the profiles; 3. Validate the framework on real samples by comparing the diversity estimates produced by DGGE and by a next-generation sequencing technology; 4. Quantify and compare the effect of pentachlorophenol on the diversity of soil bacterial communities and on the soils' fluorescein diacetate hydrolytic activity. Based on these objectives, an analytical approach was developed on in silico DGGE profiles using the software Matlab. Unlike commercial software programs that use a virtual rolling disk to subtract the DGGE profile background noise, this framework uses a background profile manually adjusted by the analyst. This background noise is used to define a new parameter, the peak-to-signal ratio that was proved to be related to community richness. Then, the information about the relative abundance of the dominant species is extracted using a semi-automated algorithm, thus facilitating the analysis of complex DGGE profiles. Using the information extracted from the profiles, an empirical framework allowing the accurate estimation of the diversity of soil bacterial communities was developed. The partial rank-abundance distributions produced by the DGGE bands quantification step are first of all normalized using the peak-to-signal ratios extracted from the profiles. Then, using the power law abundance model, an elongation model was parameterized using the complete rank-abundance distributions used to synthesize the in silico DGGE profiles. Because the model parameters depend on the peak-to-signal ratios, the elongation process is therefore sample specific. To further validate this elongation model, the diversity of the bacterial communities of eight different soil samples were studied using both DGGE profiling and Ion Torrent sequencing, a next-generation sequencing platform. Two differently textured soils were used, a loamy and a sandy soil. For each soil, four subsamples were prepared; one was kept clean and the three others were contaminated with different concentrations of pentachlorophenol. The ecotoxicological effects of pentachlorophenol on the diversity of soil bacterial communities was further studied using the two same soils. This time, seven different pentachlorophenol concentrations were used and all the samples were prepared in triplicate. The samples' fluorescein diacetate hydrolytic activity was also measured. Concentration-response modeling was conducted on the two types of indicators (diversity and activity). Furthermore, ecotoxicological databases were screened in order to find data on the toxicity of pentachlorophenol to terrestrial species. These data were used to draw a species sensitivity distribution – representative of the range of sensitivity of terrestrial species exposed to pentachlorophenol – that was compared with the above-mentioned concentration-response curves. Working on in silico DGGE profiles, it was shown that the representativeness of the results produced by commercial gel analysis software programs was sample-dependent. On the contrary, the Matlab-based framework presented in this thesis allowed the extraction of accurate peak-to-signal ratio values and the production of representative dominance profiles for all the analyzed samples. It was shown that these dominance profiles were very similar to those produced by DNA sequences clustering algorithms when using a similarity level of 98%. The elongation model calibrated with the sequencing datasets used to synthesize the in silico DGGE profiles showed great potential. Calibrated in order to reproduce the rank-abundance distributions generated by sequencing datasets clustering at 98% similarity, the framework allowed the estimation of the diversity of the studied communities with a precision generally higher than ± 5%. A very significant correlation was found between those DGGE-based diversity estimates and true diversity at a similarity level of 98% (R2 > 0.99). Using two different techniques to study the same bacterial communities allowed identifying biases in the results of both technologies. For DGGE, it was clearly shown that injecting too much DNA in the wells (~ 400 ng) could cause localized gel saturation, hampering the brightest peaks to reach their full intensity and thus underestimating the dominance of the communities. Injecting less DNA (~ 200 ng) was a simple remedy against this problem. The situation was much more complex for Ion Torrent sequencing. Used at the limit of its capacity, the quality of the dataset produced by this platform was low. As a consequence, biases linked with sampling depth and sequencing errors were identified. Furthermore, it was qualitatively shown that GC content considerations were susceptible to cause intra-sample distortions in the relative abundance of species. Furthermore, all these biases were sample-dependent. Reducing the quantitative importance of some biases allowed finding a significant correlation between the diversity estimates produced by DGGE and Ion Torrent sequencing (R2 > 0.81). For comparative diversity studies, these two approaches can therefore yield similar ecological conclusions. While constructing concentration-response curves from the ecological diversity indices, it was observed that the most contaminated soils were not the least diversified ones. Such a result could happen if the toxic effect of pentachlorophenol was so high that even the tolerant species were unable to grow, thus hampering the apparition of bright bands on the DGGE profile. At the same time, it is also possible that pentachlorophenol induced a high bacterial mortality and that the DNA of these organisms, released in the soil, was not degraded during the 28 day incubation period. Notwithstanding the above, ecological diversity indices proved to be at least 25 times more sensitive to pentachlorophenol than the soils' fluorescein diacetate hydrolysis activity, meaning that structural changes could happen before functional losses are observed. The most promising result was, without a doubt, a very good correspondence that was found between the diversity-based concentration-response curves and the species sensitivity distribution that was observed for pentachlorophenol. This thesis allowed developing a complete framework allowing the comparison of soil bacterial community diversity using DGGE, a widespread technique that was unable to do so before. Furthermore, it was shown that diversity-based indicators were more sensitive to pentachlorophenol than some integrative functional indicators and that the response of soil bacterial communities to pentachlorophenol was highly similar to the response of macroscopic terrestrial communities exposed to the same substance. If this similarity can be established for other contaminants or classes of contaminants, this methodology has the potential to help fill many gaps in terrestrial ecotoxicological databases and in the understanding of the effect of xenobiotics or complex mixtures on terrestrial ecosystems. And if these similarities are fortuitous, the framework can still provide relevant information about the toxicity of xenobiotics to organisms poorly represented in the ecotoxicological databases; soil bacterial, archeal and fungal communities.