Quantification de l'immunomarquage spécifique par nanoparticules plasmoniques sur lignées cellulaires cancéreuses

Le cancer est une maladie extrêmement complexe et les traitements disponibles sont multiples. L’un d’eux, l’immunothérapie, cible spécifiquement certaines protéines surexprimées par les cellules cancéreuses pour les traiter avec des effets minimaux sur les cellules saines. Pour prédire l’efficacité d’un tel traitement, le pathologiste a besoin de vérifier et de quantifier la surexpression des antigènes par les cellules cancéreuses du patient. Dès lors, l’usage de diagnostics « compagnons » est nécessaire. En clinique, l’étalon d’or pour ce type de marquage est l’immunohistochimie (IHC) réalisée sur biopsie, accompagnée d’une contre-coloration à l’hématoxyline ou à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). Cette technique repose sur l’utilisation de chromophores qui colorent les zones de l’échantillon exprimant l’antigène. L’information obtenue est double : l’intensité de la coloration fournit une information semi-quantitative alors que sa localisation, couplée à l’H&E, donne une information anatomique et spatiale. Pour autant l’IHC est limitée par son caractère semi-quantitatif bien qu’une mesure quantitative soit souhaitable. De plus, l’IHC permet difficilement le multiplexage alors qu’il accélérerait et améliorerait la précision des diagnostics. L’immunoplasmonique (IP) se présente comme une alternative. Le recours à des nanoparticules plasmoniques (NPs) conjuguées à des anticorps permet un marquage spécifique, le décompte des nanoparticules attachées est relativement simple et renvoie un score quantitatif. Par ailleurs, il a déjà été démontré au Laboratoire de Plasmonique et de Procédés Lasers (LP2L) la compatibilité de quatre NPs de différentes couleurs avec la contre-coloration H&E, accentuant le potentiel de l’IP en clinique. L’objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité de l’IP pour la quantification de plusieurs antigènes sur plusieurs lignées cellulaires. Les résultats d’IP sur quatre lignées cellulaires et six antigènes aux expressions variées sont comparés aux résultats d’immunofluorescence (IF). Une quantification de l’IF et de l’IP permet de démontrer la spécificité du marquage IP sur le CD44 et pourrait atteindre la limite de sensibilité sur le PDL1. Il a été observé que la sensibilité de l’IP peut être améliorée en optimisant le temps d’incubation. La spécificité de l’IP anti-CD44 a été confirmée par une coculture de deux lignées avec une expression très différente pour ce marqueur. Certains marqueurs ont été identifiés comme plus difficile à cibler par l’IP ; plusieurs explications possibles sont avancées même si les causes exactes n’ont pas encore été confirmées.

Abstract

Cancer is an extremely complex disease with multiple treatment options. One of them, immunotherapy, specifically targets certain proteins overexpressed by cancer cells to treat them with minimal effects on healthy cells. To predict the efficacy of such a treatment, the pathologist needs to verify and quantify the overexpression of antigens by the patient's cancer cells. Therefore, the use of "companion" diagnostics is necessary. In the clinic, the gold standard for this type of labeling is immunohistochemistry (IHC) performed on biopsies, accompanied by hematoxylin or hematoxylin and eosin (H&E) counterstaining. This technique is based on the use of chromophores that stain the areas of the sample that express the antigen. The information obtained is twofold: the intensity of the staining provides semi-quantitative information while its localization, coupled with H&E, provides anatomical and spatial information. However, IHC is limited by its semi-quantitative nature when a quantitative mesure is desirable to better guide the pathologist's choice. Moreover, IHC does not allow multiplexing that would accelerate and improve diagnoses accuracy. Immunoplasmonics (IP) is an alternative. The use of plasmonic nanoparticles (NPs) conjugated to antibodies allows for specific labeling while counting of attached NPs is relatively simple and quantitative. Moreover, the compatibility of four NPs of different colors with H&E counterstaining has already been demonstrated at Laboratory of Laser Processing and Plasmonics (LP2L), emphasizing the potential of the IP in the clinic. The goal of this project is to demonstrate the efficiency of IP for the quantification of several antigens on several cell lines. IP results on four cell lines and six antigens with various expressions are compared to immunofluorescence (IF) results. Quantification of IF and IP demonstrates the specificity of IP labeling on CD44 and might reach the limit of sensitivity on PDL1. It was observed that the sensitivity of IP can be improved by optimizing the incubation time. The specificity of the anti-CD44 IP was confirmed by co-culturing two lines with very different expression for this marker. Some markers were identified as more difficult to target by IP; several possible explanations have been put forward even if the exact causes have not yet been confirmed.