Étude de l'angiogenèse et de la distribution des cellules souches mésenchymateuses dans des défauts ostéochondraux chez le lapin

Les défis majeurs de la recherche orthopédique actuelle sont la restauration, le maintien et l'amélioration des tissus du système musculo-squelettique, afin de remédier aux déficiences causées par des maladies, telles que l'arthrite rhumatoïde et l'arthrose. En 2011, plus de 16 % de la population canadienne recensée souffrait de ces maladies, ayant donc à endurer des douleurs articulaires et une mobilité réduite des articulations affectées. À cause de l'absence de vaisseaux sanguins dans le cartilage et la faible densité cellulaire, le processus de réparation tissulaire n'est amorcé que difficilement au niveau de lésions du cartilage. Diverses techniques chirurgicales ont donc été développées pour stimuler la réparation ou la régénération du cartilage, incluant par exemple les transplantations de chondrocytes autologues et les techniques de stimulation de la moelle osseuse. Ces dernières sont parmi les plus utilisées et la stimulation de la moelle osseuse définit des techniques chirurgicales basées sur la microfracture ou la microperforation du cartilage et de l'os sous-jacent. Dans ce cas, la réparation est possible grâce à la création de canaux, qui permet la formation d'un caillot sanguin et l'infiltration des cellules souches mésenchymateuses, à partir des dommages causés au système vasculaire de l'os sous-chondral. Cependant, de nombreuses études ont démontré que le cartilage résultant était un mélange de cartilage hyalin et de cartilage fibreux, dont les propriétés mécaniques sont insuffisantes pour restaurer la mobilité initiale de l'articulation. Comme montrée dans de précédents travaux entrepris au laboratoire, la combinaison des techniques de microperforation avec un implant composé de chitosan, de glycérolphosphate et de sang autologue permet d'améliorer la qualité du cartilage réparé. Ceci est possible grâce au recrutement de plusieurs populations cellulaire au site de la lésion, comme les neutrophiles et les macrophages, et à travers divers mécanismes biologiques, incluant l'angiogenèse et la chondrogenèse. Il a été démontré que la solidification in situ de l'implant pouvait être accélérée par l'ajout de facteurs de coagulation. Les facteurs testés sont la thrombine (IIa), le facteur VIIa recombiné humain (rhFVIIa) et le facteur tissulaire (TF). Ils ont été ajoutés à l'implant chitosan-GP/sang, afin d'accélérer la solidification in situ au cours de l'application clinique , qui pourrait rendre possible la livraison de l'implant par arthroscopie. Dans un modèle lapin de microperforation, l'implant chitosan-GP/sang solidifié in situ par la thrombine permet d'améliorer la qualité du cartilage réparé vis-avis la thrombine seule (Marchand et al., 2012). Cependant, l'effet précis des facteurs de coagulation sur l'angiogenèse et les mécanismes de réparation tissulaire doivent encore être étudiés. Dans cette étude, les deux hypothèses suivantes sont posées : - L'ajout de facteurs de coagulation, notamment la thrombine (IIa), le facteur VIIa recombiné humain (rhFVIIa) et le facteur tissulaire (TF) + rhFVIIa, à la solution de chitosan, de glycérolphosphate et de sang autologue, engendre plus d'angiogenèse dans l'os sous-chondral des microperforations en réparation par rapport à la microperforation seule, à 3 semaines postchirurgie dans un modèle lapin de la stimulation de la moelle. - L'utilisation de l'implant chitosan-GP/sang, avec les techniques de stimulation de la moelle osseuse, attire un plus grand nombre de cellules souches mésenchymateuses (MSC) aux lésions microperforées, comparativement à l'utilisation des techniques de stimulation de la moelle osseuse seules. Pour répondre à ces hypothèses, les objectifs de cette étude sont les suivants : - Évaluer l'effet de l'implant chitosan-GP/sang coagulé dans la lésion avec la thrombine (IIa), du facteur VIIa recombiné humain (rhFVIIa) et du facteur tissulaire (TF) + rhFVIIa sur la réparation du cartilage induite par la microperforation, par rapport à la microperforation seule, à partir de la quantification stéréographique des vaisseaux sanguins et des données histomorphométriques de la matrice extracellulaire du tissu de granulation; - Proposer des anticorps qui se lient aux cellules souches humaines et qui peuvent être utilisés en immunohistochimie pour détecter des MSC dans les tissus de lapin NZW et dans des coupes osteochondrales; - Localiser les MSC dans les lésions microperforées dans le cartilage, pour une meilleure compréhension du processus de réparation du cartilage. Dans la première partie de ce projet de mémoire, l'effet de l'implant chitosan-GP/sang avec ou sans un facteur de coagulation a été étudié à travers une méthode stéréographique. Cette dernière permet de récolter des données quantitatives reproductibles, qui peuvent être comparées aux données d'études passées et d'études futures. L'augmentation de la densité de surface et de volume des vaisseaux sanguins pour des implants avec IIa ou rhFVIIa ajouté montrent que ces facteurs de coagulation peuvent stimuler plus d'angiogenèse dans l'os sous-chondral au cours de la réparation induite par microperforation. Il a également été démontré que l'implant chitosan-GP/sang retarde le dépôt des fibres de collagènes (de type I et de type II) dans la matrice extracellulaire. Dans la deuxième partie de ce mémoire, les anticorps contre la β-catenin, la nestin et l'actine αSMA ont été utilisés pour des tests d'immunohistochimie, afin de détecter les cellules souches mésenchymateuses dans les tissus d'études animales in vivo. Malgré l'absence de signal positif avec les anticorps anti-β-catenin et anti-nestin, l'actine αSMA a été détectée dans divers tissus du lapin NZW, incluant les tissus fœtaux, les tissus adultes du foie, du poumon, de la peau, du placenta, de la trochlée intacte ou en réparation. Les résultats obtenus dans les tissus de trochlée en réparation montrent que les cellules exprimant l'actine αSMA sont localisées sur les bords de la microperforation, ainsi qu'à la surface du tissu de granulation. Bien que des tests supplémentaires soient nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes impliquant les MSC, les colorations IHC effectuées indiquent que les cellules αSMA-positives sont des « bone lining cells » et qu'elles sont impliquées dans le processus de remodelage et réparation de l'os, et dans les « pre-chondrogenic foci » survenant à l'intersection du tissu de granulation et de l'os nouvellement formé. Les pre-chondrogenic foci, qui sont formés à la surface des plaques sous-chondrales, sont les structures précoces du cartilage articulaire régénéré. Dans son ensemble, cette étude a permis des informations supplémentaires sur l'implication de l'angiogenèse et des cellules souches mésenchymateuses lors de la réparation du cartilage et de l'os sous-chondral. Elle bénéficie aux progrès de la recherche dans ce domaine en démontrant que l'angiogenèse et les MSC sont des éléments détectable et quantifiable dans le tissu de granulation des lésions microperforées du cartilage, avant l'émergence des « chondrogenic foci ». Des études futures devraient être en mesure d'optimiser l'implant chitosan-GP/sang par la sélection d'additifs, comme les facteurs de coagulation, qui peuvent améliorer l'efficacité et la durabilité de la réparation du cartilage. L'un des buts majeurs est de pouvoir engendrer la formation d'un cartilage « purement » hyalin à travers la promotion de l'angiogenèse et du recrutement des MSC pour restituer le cartilage à son état sain initial.

Abstract

The major challenges of current orthopedic research are the restitution, preservation and improvement of the musculoskeletal system, in treating degenerative diseases such as osteoarthritis and rheumatoid arthritis. In 2011, these diseases affected more than 16% of the population in Canada, leading patients to suffer articular pain and reduced mobility of the joint. The absence of repair in focal lesions of articular cartilage can be explained by the avascular nature of the cartilage tissue and its low cellular density. Hence various surgical techniques were developed to trigger the repair of the cartilage and the subchondral bone, as for example autologous chondrocyte transplantation or bone marrow stimulation. The latter surgical technique uses microfracture or microdrilling in the cartilage and bone tissues and is one of the most commonly used. It creates access channels to the subchondral bone to allow the formation in situ of a blood clot and the migration of mesenchymal stem cells, through the rupture of subchondral vasculature. But studies have shown that the produced cartilage is a mixture of fibrous and hyaline cartilage, which cannot sustain the same loads as intact hyaline cartilage in the joint. Thus a chitosan-based implant was developed to induce more hyaline cartilage repair and ensure the residency of the otherwise fragile blood clot in the cartilage defect. Previous work in our laboratory has shown that combining bone marrow stimulation techniques with a solution of chitosan, glycerol phosphate and autologous blood enhances the cartilage quality through mechanisms involving various cellular populations, such as neutrophils and macrophages, and different repair processes, such as angiogenesis and chondroinduction. It was shown that the in situ solidification of the chitosan-GP/blood implant can be accelerated by the addition of the coagulation factors, such as thrombin (IIa), tissue factor (TF) and recombinant human Factor VIIa (rhFVIIa). These coagulation factors were added to the chitosan-based implant to accelerate in situ solidification of the implant for clinical application, which could potentially allow implant delivery by arthroscopic injection. In a rabbit microdrill model, thrombin-solidified implant improved cartilage repair over thrombin-treatment alone. However, the precise effect of coagulation factors on angiogenesis and the repair process has yet to be elucidated. Thus, the purpose of this study was to test the following two hypotheses: - The addition of coagulation factors, including thrombin (IIa), tissue factor (TF) and recombinant human Factor VIIa (rhFVIIa), to the chitosan-GP/blood implant enhances subchondral angiogenesis in repairing microdrilled defects, compared to microdrilling alone, at 3 weeks post-operative in a rabbit model of cartilage repair. - The use of a chitosan-GP/blood implant with microdrilling attracts more mesenchymal stem cells to the microdrilled cartilage defect, in comparison to bone marrow stimulation techniques alone. To test these hypotheses, the study's principal aims were: - To evaluate the effect of the chitosan-GP/blood implant coagulated in the microdrilled lesion with coagulation factors, including thrombin (IIa), tissue factor (TF) + rhFVIIa and recombinant human Factor VIIa (rhFVIIa), on cartilage repair compared to microdrilling-alone, through blood vessel stereology and extracellular matrix histomorphometry data; - To identify the antibodies that recognize human stem cell markers that can be used for immunohistochemistry in NZW rabbit tissues and osteochondral samples; - To locate the MSC in the microdrilled defects and to better understand the cartilage repair process. In the first part of this study, the effect of the chitosan-GP/blood implant with or without added coagulation factor was investigated through a stereological method. It results in quantitative reproducible data, which allows comparison to data from previous and future studies. The observed increase in blood vessel surface and volume density for implant with either thrombin or recombinant factor rhFVIIa, indicates that these coagulation factors enhance subchondral angiogenesis in the chitosan-induced cartilage repair. It is also shown that the chitosan-GP/blood implant delays collagen (type I and type II) deposition in the extracellular matrix. In the second part of this study, antibodies for β-catenin, nestin and αSMA were used in immunohistochemistry tests in rabbit tissues in order to detect mesenchymal stem cells in tissues collected from in vivo studies. Although positive signals for β-catenin and nestin were not obtained, αSMA was detected in various tissues, including foetal tissue, adult lung, skin, liver, placenta, osteochondral repairing and intact tissue from NZW rabbit animal models. Results in repairing osteochondral tissue also demonstrated the presence of αSMA expressing cells at the edges of the microperforated subchondral bone defect and at the surface of the granulation tissue in NZW rabbit osteochondral sections. Further tests would be necessary to full understand the mechanisms implicating mesenchymal stem cells, but the IHC results do show that αSMA expressing cells are bone lining cells and that they are implicated in the bone remodelling and repair processes, and are present in “pre-chondrogenic foci” structures occurring at the interface between the granulation tissue and the newly formed bone. Chondrogenic foci that form along the repairing subchondral bone plate are the precursor structures that regenerate hyaline articular cartilage. Altogether, this study allowed a better understanding of the implication of angiogenesis and mesenchymal stem cells in subchondral bone and cartilage repair. It benefits research in the field, as it shows that angiogenesis and mesenchymal stem cells are important process that can be located and quantified in the drilled defect granulation tissue, before the emergence of chondrogenic foci. Future studies should be able to determine which additive, such as coagulation factor, can enhance the chitosan-GP/blood implant efficiency and generation “pure” articular cartilage through the promotion of subchondral angiogenesis and mesenchymal stem cell recruitment in repairing drilled defects.